1. 研究目的与意义
一、内容：
1、卷柏化学成分的提取；
2、供试样品的衍生化；
2. 文献综述
卷柏化学成分及衍生化GC-MS技术研究进展
周 晨130205127中药资源与开发1301
【摘要】卷柏是典型极端耐旱的复苏维管植物，具有多种生物活性而被广泛应用于临床实践。研究发现，卷柏含有黄酮类、炔酚类、苯丙素类等多种化学成分。其主要化学成分穗花杉双黄酮在抗癌抗肿瘤、降血糖降血脂、抗菌、抗氧化、扩张血管、降血脂、保肝等方面均表现出良好的生物活性。本文对卷柏化学成分及生物活性进行归纳总结，并对GC-MS技术进行综述，以期为日后进一步对卷柏的质量评价研究和综合开发利用提供参考。
【关键词】卷柏；衍生化GC-MS；化学成分；成分分析
卷柏[Selaginella tamariscina (Beauv.) spring]，为蕨类植物门石松纲卷柏目卷柏科卷柏属植物，多年生草本。卷柏为传统中药，具有破血散瘀、活血止血的功能，早在《神农本草经》中便列为上品记载。2015年版《中国药典》[1]收载了卷柏[S.Tamariscina（Beauv.）Spring]和垫状卷柏[S. pulvinata( Hook.Grev.) Maxim]为法定药材。民间作为药用的有江南卷柏[S. moellenddorfiiHieron]、兖州卷柏[S. involvensspring]，深绿卷柏[S. DoederleiniiHieron]，薄叶卷柏[S. Delicatula]等20多个品种。民间验方多用其治疗心血管疾病以及肿瘤等，具有较为显著的疗效。
1.卷柏的特征与分布
卷柏在干旱条件下植株向内卷成团，颜色枯黄，但仍能在长时间内保持生命，一旦遇水，植株便会伸展、返绿，故民间称其为九死还魂草[2]。《中国植物志》记载，卷柏极耐干旱，大多生长于荒山野岭及干旱的向阳山坡岩石缝隙中，是典型的复苏维管植物，根托只生于茎的基部，各枝扇状分枝至2～3回羽状分枝，密被覆瓦状叶，叶交互排列，质厚，表面光滑，全缘状。孢子叶穗紧密，四棱柱形，孢子叶穗上下两面不规则排列有大孢子叶[3]。目前已发现的约有700种，广泛分布于世界各地，在我国不同地区分布有60余种[4]，其中22种具有药用价值（表1）。
表1 常用卷柏属药用植物及分布
编号 | 植物名 | 植物学名 | 我国主要分布 |
1 | 卷柏 | S.tamariscina（P.Beauv.）Spring | 江苏、福建、浙江、东北等地 |
2 | 江南卷柏 | S.moellendorffiiHieron. | 云南、安徽、甘肃、广东等地 |
3 | 中华卷柏 | S.sinensis（Desv.）Spring | 东北、山西、河南、陕西等地 |
4 | 垫状卷柏 | S.pulvinata（Hook.et.Grev.）maxim. | 贵州、广西、西南地区 |
5 | 薄叶卷柏 | S.delicatula（Desv.）Alston | 重庆、福建、广西、湖北等地 |
6 | 翠云草 | S.uncinata（Desv.ex Poir.）Spring | 浙江、福建、台湾、广东等地 |
7 | 兖州卷柏 | S.involvens（Sw.）Spring | 陕西、江浙、华南、西南地区 |
8 | 疏松卷柏 | S.effusaAlston | 湖南、贵州、福建、广西等地 |
9 | 深绿卷柏 | S.doederleiniiHieron. | 浙江、安徽、福建、贵州等地 |
10 | 毛枝卷柏 | S.brauniiBaker. | 四川、湖北、浙江等地 |
11 | 细叶卷柏 | S.labordeiHieron.ex Christ | 陕西、贵州、云南、安徽等地 |
12 | 贵州卷柏 | S.kouycheenstsH.Lev. | 贵州、四川等地 |
13 | 异穗卷柏 | S.heterostachysBaker | 安徽、浙江、广西、云南等地 |
14 | 小翠云 | S.kraussianaA.Braun | 广东、贵州等地 |
15 | 黑顶卷柏 | S.pictaA.Br.ex Baker. | 云南、广东、广西等地 |
16 | 缘毛卷柏 | S.ciliarisSpring | 广东、广西、海南、云南等地 |
17 | 疏叶卷柏 | S.romotifoliaSpring | 福建、江西、四川等地 |
18 | 伏地卷柏 | S.nipponicaFranch.et Sav. | 福建、江浙、重庆、安徽等地 |
19 | 旱生卷柏 | S.stauntonianaSpring | 吉林、山西、宁夏、贵州等地 |
20 | 蔓生卷柏 | S.davidiii.Franch. | 山东、福建、两广、贵州等地 |
21 | 粗叶卷柏 | S.trachyphyllaA.Br. | 广西、贵州、广东等地 |
22 | 圆枝卷柏 | S.sanguinolenta（L.）Spring | 西北、华北、东北地区 |
2.卷柏化学成分研究
卷柏中含有黄酮类、苯丙素类、炔酚类、生物碱类、甾体类、萜类、蒽醌类、有机酸类及其他成分，目前认为其主要成分为双黄酮类化合物。2015年版《中国药典》收载了以穗花杉双黄酮为质控指标的含量测定方法。
2.1黄酮类化合物
日本学者 Okigawa Masayoshi等[5]于1971年首次从S．tamariscina中分离得到穗花杉双黄酮（amentoflavone）、苏铁双黄酮（sotetsuflavone）等5种黄酮类化合物，随后国内外学者从卷柏中分离得到了近百种黄酮类化合物，其中包括黄酮、双黄酮类及色原酮类等。
2.1.1黄酮类化合
目前卷柏中分离得槲皮素[6]、木犀草素[7]等黄酮类化合物。其基本结构如下：
2.1.2双黄酮类化合物
按两个黄酮母核的连接方式可以分为B-A环相连（穗花杉双黄酮[8]、红杉双黄酮[9]等）、B环-O-A环（异柳杉双黄酮[10]、扁柏双黄酮[11]等）、A-A环相连（2,3-二氢-5,7,4',5",7",3"',4'"-六羟基-8,8"-双黄酮[12]等）和C-B（taiwaniaflavone[13]等）环相连等5种类型。
2.2苯丙素类化合物
目前在卷柏中发现了简单苯丙素类、香豆素类、木脂素类等3类苯丙素类化合物，其结构如下：
2.2.1简单苯丙素类化合物
2.2.2香豆素类化合物
2.2.3木脂素类化合物
2.3酚类化合物
2.4炔酚类化合物
张丽萍等[14]于2007年第一次从中华卷柏（S.sinensis（Desv.）Spring）中分离得到炔酚酮类化合物，并将其命名为selaginellin，结构如下：
2.6其他类化合物
目前发现，卷柏中尚含胆甾醇、3β,16α- 二羟基-5α胆甾-21-酸[15]等甾体类，D-络氨酸、L-络氨酸[16]等氨基酸类化合物；葡萄糖、β-D-呋喃果糖-(2-1)-α-D-吡喃葡萄糖苷[17]等糖类化合物；海棠果酸、莽草酸[18]等脂肪酸类化合物；麦芽碱-O-α-L 吡喃鼠李糖苷、卷柏酸[19]等生物碱类化学成分。刘海青等[20]从Selaginella stauntoniana分离得到了大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸等醌类化合物
3. 卷柏的生物活性
卷柏在我国民间早已被广泛应用且已列入《中国药典》作为法定药材，现代药理研究表明，该药用植物具有抗癌抗肿瘤、降血糖、抗炎、抗菌抗病毒、免疫调节及扩张血管等生物活性。此外，相关研究报道表明卷柏属药用植物植物还有保护心肌、防辐射、止血（炒炭用）[21]等作用。
3.1抗癌抗肿瘤作用
目前卷柏在抗癌抗肿瘤方面的作用是其药理活性研究的热点。据文献报道卷柏中的黄酮类、生物碱类以及甾醇类化合物均有抗癌作用。有研究者发现卷柏的乙醇及各部位提取液也有抗肿瘤作用。齐冰[22]等采用正交试验量效比对法优选了卷柏抗SMMC-7721肝肿瘤组分总黄酮的提取工艺。邱丹缨等[23]采用MTT法发现兖州卷柏生物碱对肝癌H22细胞有明显抑制作用。2012 年，曹园[24]等发现炔酚类化合物在胃腺癌 BGC-823、非小细胞性肺癌A549及肝癌BEL-7402 等人类癌细胞系中具有选择性的细胞毒活性。Zhang GG[25]等对从卷柏中新分离得到的selaginellin M和selaginellin N进行细胞毒活性评估，结果发现其在He La细胞、U251人脑胶质瘤细胞、MCF-7人乳癌细胞等人类癌细胞系中表现出一定的细胞毒作用。
3.2降血糖作用
现代药理对卷柏的一个重要研究是其降糖作用。目前认为黄酮类化合物是卷柏属药用植物的主要降糖活性物质，但也有报道卷柏中炔酚酮类化合物亦具降糖作用。Phi-Hung Nguyen等[26]从卷柏中提取出的selariscinin D和selariscinin E两个炔酚酮类化合物也表现了很强的降血糖作用。郑晓珂[27]、克迎迎[28]等发现卷柏总黄酮降糖作用的机制可能与调节P13K蛋白及visfatin蛋白，促进细胞内葡萄糖氧化分解有关。MinKyun NA[29]、郑晓珂[30]等对卷柏主要黄酮类化合物穗花杉双黄酮降糖作用进行研究，发现穗花杉双黄酮能够增加HepG2细胞对葡萄糖的基础消耗，改善糖尿病小鼠血糖紊乱，调节胰岛素分泌，对HepG2细胞的胰岛素抵抗具有一定的改善作用。
3.3 抗氧化作用
Wang C J 等[31]首次报道了卷柏中特征性炔酚酮类成分的药理活性，其研究结果表明炔酚酮类成分能有效减少同型半光氨酸诱导的内皮细胞衰老，其机制可能与抑制氧化应激和上调与衰老密切相关的 SIRT1 基因的表达有关；炔酚酮类成分能有效减少氧化应激反应抑制谷氨酸诱导的PC12细胞损伤和凋亡，其抗凋亡作用可能与上调klotho基因(抗衰老基因)的表达有关。
Chao Yang等[32]从卷柏中分出4个炔酚酮类化合物并对其进行抗氧化活性筛选，结果发现selaginellin O有很好的抗氧化活性。Jang Hoon Kim等[33]从卷柏中分出3个炔酚酮类化合物并发现这三个化合物均可溶解环氧化合物水解酶抑制活性。
3.4抗炎抗菌抗病毒作用
黄妮雯等[34]通过卷柏总黄酮对支气管哮喘大鼠气道的影响，发现卷柏总黄酮可降低哮喘大鼠IL-5的表达和炎性细胞聚积，与抑制STAT1（转录活化因子1）的表达有关，说明卷柏总黄酮具有一定的抗炎效果。卷柏中炔酚酮类化合物可抑制脂多糖在星形胶质细胞中的促炎作用，产生抗炎作用[35]。另有研究发现，垫状卷柏中的炔酚类化学成分Selaginellin、Selaginellin D和Selaginellin G 具有较好的抗白色念珠菌的活性；Selaginellin、Selaginellin A、Selaginellin B显示了较好的抗金黄色葡萄球菌的活性[36]。
4.气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术
单用气相色谱（GC）能够高效的分离混合物但并不善于鉴定各个组分；而单用质谱检测器（MS）善于鉴别单一的组分却难以鉴别混合物，因此人们研究将两种方法联合在一起使用，组成了气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）。气相色谱-质谱联用始于20世纪50年代后期，该技术结合气相色谱高分离效能和质谱准确鉴定化合物结构的优点，既可定性又可定量分析。具有高通量、高灵敏度、高分离度、高解析能力且自带结构鉴定谱库的特点，可同时准确快速测定中药中多种化学成分，因此被国内外研究者开发和应用。
4.1GC-MS的适用范围
GC-MS特别适用于易挥发或易衍生化合物的分析[37]及多组分混合物中未知组分的定性定量分析、化合物的分子结构判别、化合物分子量测定，是一种很完善的现代分析方法[38]。但是，待测组分必须是可挥发的、沸点一般500℃以下，并且具有热稳定性才能用气相色谱直接分离。目前可以用气相色谱直接分析的化合物占已知化合物总数的20%~25%，对于不能气化的组分，通过衍生化处理后亦可进行分析。
4.2衍生化GC-MS的优势
衍生化可以改善待测物的气相色谱性质以及热稳定性。衍生化后使待测物的分子量增大，有利于使待测物和基质分离，降低化学背景干扰的影响，从而改善待测物的质谱行为。大多数情况下，衍生化后的待测物会产生较有规律且容易解释的质量碎片。在代谢物组学研究中，经常将样品衍生化（如烷基化等）以降低组分的沸点或使待测组分具有一定挥发性，增加可检测组分的种类。可以说GC-MS是最成熟的色谱质谱联用技术。
5.GC-MS前处理方法研究进展
中药分析现代化方法倾向于快速、灵敏的测定样品中微量、痕量化学成分。现代化分析仪器（如 GC-MS、ICP等）都采用计算机自动化处理系统，可在极短时间内完成目标物的分析，也正因此，对样品的要求就更高。而样品的制备决定了分析结果的准确性，所以选择合理的前处理方法具有重要意义。目前常用GC-MS前处理方法有液-液萃取、固相萃取、液相微萃取、膜萃取、顶空处理技术等。
5.1液-液萃取
液-液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）是根据目标物质在两种互不相混溶的液体间的分布定律来提取目标成分的方法，该方法主要用于水中半挥发或不易于挥发性有机物提取。液-液萃取使用仪器（分液漏斗）简单，目前在实验中使用较为广泛[39]。
5.2固相萃取
固相萃取是一种基于液相色谱原理的分离、纯化方法，其萃取剂一般为液相色谱固定相。目前固相萃取法分为传统固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）和固相微萃取（Solid Phase Microextraction，SPME）两种。
5.3液相微萃取
液相微萃取（Liquid Phase Microextraction，LPME）是1996年由Jeannot和 Cantwell[40]提出的一种结合了LLE和SPME二者优点的方法。该方法溶剂用量少、快速、廉价，且萃取与进样简单，只需一个极简单的装置微量进样器。其基本原理与LLE相似，是有机物在不同相之间进行分配富集的过程。它是微型化的液-液萃取，但对微量待测物的富集作用是传统LLE不能及的，不需要进一步浓缩过程，灵敏度与LLE相当[41]。
5.4膜萃取
膜萃取（Membrane Extraction，ME）是采用高分子膜、中空纤维膜等将待测物从样品溶液萃取到萃取剂中的一种新型净化富集技术，被认为是20 世纪末到21世纪中期最有发展前景的技术之一。该技术将一微孔膜置于原料液与萃取剂之间，因萃取剂对膜的浸润性而迅速地浸透膜的每个微孔并与膜另一侧原料液相接触形成稳定界面层，微分离溶质透过界面层从原料液移到萃取剂中，从而达到分离富集的目的[42]。如今微滤、超滤、透析、电渗析、反渗透等技术都由此开发而来。该技术已在医药、食品、环境等各领域广泛应用[43]。
5.5顶空处理技术
顶空处理技术（Headspace，HS）是一种非常适合于测定固体或液体样品中挥发性有机物的技术。顶空萃取技术主要取决于被分析物在气相和液或固相间的分配系数，平衡向液相部分迁移越多，待测组分可检测灵敏度则越低，反之则越高。而分配系数又主要取决于待测物的蒸汽压和其在水中的活度系数。降低平衡温度或升高活度系数可增加液相中有机物的量，从而使分析灵敏度降低；待测物不易挥发，溶解度高也可使分析灵敏度降低[44]。顶空气态取样避免了直接在液体或固体取样时，复杂的样品基体成分被一起带入分析仪器的可能性，从而消除了基体成分的影响和干扰[45]。目前顶空萃取技术主要分为两种类型，即静态顶空和动态顶空。
6.基于GC-MS的卷柏化合物研究现状
由于卷柏化学成分大多不挥发或难挥发，因此目前对其成分的测定方法大多为高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）等。王雪等[46]利用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、制备型高效液相色谱等手段进行分离和纯化，从卷柏的乙醇提取物中分离得到β-谷甾醇、3β-羟基- 7α-甲氧基- 24β-乙基-胆甾-5-烯、胆甾醇等13个化合物。毕跃峰等[47]利用大孔吸附树脂、SePhadxeLH-20、硅胶柱色谱进行分离纯化，从卷柏中分离得到卷柏苷、D-甘露醇、酪氨酸、莽草酸等4个化合物。此类分析方法已比较成熟，但依旧存在其局限性。目前极少有卷柏中化学成分的气质联用检测报道。鲁曼霞等[48]利用GC-MS研究了3种卷柏属植物挥发性化学成分。然而，目前未见利用衍生化GC-MS测定卷柏中多种化学成分的相关报道。
7.结语
纵观以上卷柏和GC-MS的概况可以看出，GC-MS与其他分析方法相比，在中药化学成分的测定方面具有很多优势。衍生化GC-MS技术更是弥补了GC法只能测定挥发性成分这一弱点，使得其应用范围更加广泛。卷柏所含化学成分结构类型复杂多样、生物活性广泛，且目前多用液相等方法分离分析，暂无应用衍生化GC-MS测定卷柏中多种化学成分的报道，具有相当大的研究实践价值。21世纪的色谱质谱联用技术仍将在医药等生命科学领域显示其蓬勃的生命力，应用衍生化GC-MS测定卷柏化学成分对今后揭示其复苏机理及其综合开发利用也具有重要意义。
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3. 设计方案和技术路线
4. 工作计划
第一阶段：2017年1月：导师指导、文献查询，形成研究思路；
第二阶段：2017年2月至3月：进行预实验、优化实验条件；
第三阶段：2017年4月至5月：根据方案完成实验研究；
5. 难点与创新点
1、卷柏所含化学成分结构类型复杂多样、生物活性广泛，仍有许多待分离检测的化合物类型；
2、利用衍生化GC-MS可以改善待测物的气相色谱性质和热稳定性，扩大应用范围；
3、目前极少有采用衍生化GC-MS对卷柏多种化学成分进行检测的研究报道。
