1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
兔病毒性出血症以及多杀性巴氏杆菌病，两者的发病率和病死率都极高，给家兔养殖业造成巨大的经济损失，为了更好的控制和预防两种病的发生，分别建立了以vp60蛋白基因为引物建立RHDV-VP60-ELISA检测方法和以兔多杀性巴氏杆菌菌体破碎后的菌液作为抗原建立检测兔多杀性巴氏杆菌抗体的ELISA检测方法。李云琴等[1]以原核表达的重组VP60蛋白作为诊断抗原，建立检测兔出血症病毒抗体的VP60-ELISA诊断方法。该方法检测的3种兔病（兔轮状病毒、仙台病毒和魏氏梭菌)的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1∶12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于4.9%和6.9%。Collins等[2]1995年建立的竞争ELISA，抗RHDV的兔血清能有效阻断单抗与抗原的反应，比HI敏感性高。郭明璋[3]等采用P.m的jiamoduotang 及外膜蛋白做抗原，以辣根过氧化物酶-葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA）代替酶标第二抗体，建立快速检测兔巴氏杆菌病抗体的ELISA试验。1986年，Manning等用LPS作为抗原对5株P.m分离株进行ELISA检测[4]。
间接ELISA检测方法的建立为检测RHDV和巴氏杆菌菌体提供了特异、敏感、快速、操作简便经济的检测方法。
[1] 李云琴,赵美盈,刁富花.兔病毒性出血症病毒重组蛋白VP60间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[J].中国畜牧兽医,2013,40(07):69-72.
2. 研究的基本内容和问题
分别用重组的RHDV VP60抗原蛋白和兔多杀性巴氏杆菌菌体破碎抗原液作为包被抗原，应用方阵法确定抗原包被浓度和血清稀释倍数，并对抗原包被时间、抗原封闭液、抗原封闭时间、血清孵育时间、二抗稀释倍数、二抗孵育时间、底物显示时间等实验条件进行了优化，建立间接ELISA检测方法，并对该方法的稳定性、特异性进行测定。
3. 研究的方法与方案
重组兔 RHDV VP60及RHDV阴阳性血清，多杀性巴氏杆菌菌体抗原液及巴氏杆菌的阴=阴阳性血清由江苏省农业科学院兽医所实验室提供及保存。
实验操作方法：
1.加用包被液稀释后的抗原（巴氏杆菌0.5μg/ml,每孔加100μl，37℃ 2h ；RHDV VP60 1：200稀释，每孔100μl，4℃过夜）
4. 研究创新点
目前国内主要通过血凝抑制试验进行RHDV抗体检测，但该方法存在主观性且重复性差，检测效率低，不适合大批量检测等缺点。以RHDV作为包被抗原的ELISA往往因病毒纯化不良，易出现非特异性而存在生物安全问题。本实验选择RHDV VP60 替代RHDV作为包被抗原，建立间接Elisa方法，保证了检测方法的高度敏感性和特异性，且重组vp60具有良好的反应原性。
本试验所建立的兔多杀性巴氏杆菌病抗体间接ELISA检测方法具有较好的特异性和稳定性，并且本试验ELISA方法的血清稀释倍数（1:100），操作简单，误差小，对血清样本的检测准确，适于对大批量临床血清样本的检测。本试验还对ELISA试验条件（抗原包被时间、封闭液、封闭时间、血清孵育时间、二抗稀释倍数、二抗孵育时间、显色时间等）进行了优化，从而使建立的ELISA方法更加精准。与间接血凝试验、琼脂凝胶扩散试验等血清学检测方法相比，本试验建立的方法特异性强、稳定性较好，并且操作简单，易于掌握，更具明显优势。5. 研究计划与进展
将五个兔场收集的血清分别进行RHDV vp60和巴氏杆菌菌体Elisa检测，从而说明建立两种ELISA检测方法在实际应用中都具有良好的特异性和敏感性。
