1. 研究目的与意义(文献综述包含参考文献)
1. 糖基化修饰糖基转移酶(Glycosyltransferases, GTs)在生物中广泛存在,是一种分歧度很高的多源基因家族,其主要功能是识别多种受体,并将糖从尿苷二磷酸激活的糖分子转移到受体小分子形成各种糖苷化合物[1-3]。
从UGT的结构可以推断出,其N端负责与糖受体结合,C端负责与糖供体结合[4]。
糖基有各种各样的供体分子,常见的主要有糖类、磷酸糖、核苷磷酸糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸[5]。
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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
2.1主要研究内容本课题主要对糖基转移酶UGT78D2进行异源表达、纯化以及酶学性质方面的研究,主要研究内容有:(1)选择具有良好应用潜力的糖基转移酶UGT78D2序列;(2)进行工程菌构建,活化并保藏甘油菌,提取质粒,进行核酸电泳;(3)将重组质粒转化进大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)、重组菌甘油保藏;(4)诱导表达重组酶,菌体收集与破碎,制备粗酶液;(5)测定蛋白浓度,纯化酶;(6)进行SDS-PAGE分析;(7)重组蛋白的酶学性质研究并以槲皮素为底物进行生物转化实验。
2.2研究方法1、蛋白表达与纯化(1) 采用实验室质粒提取试剂盒提取重组质粒,核酸电泳检验质粒是否成功提取。
(2)采用热激法,将已有的含有蛋白酶的重组质粒转化到大肠杆菌中,后将重组菌转移至LB培养基中,摇瓶培养,培养一定时间后,诱导表达产酶。
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