1. 研究目的与意义
研究内容：漆酶是一种重要的氧化酶，它具有多种酶催化功能，其中对于多酚类物质的氧化聚合过程具有非常好的催化效果。漆酶可以把一些小分子酚类底物氧化聚合从而产生其二聚体，这些二聚体产物不仅具有化学结构的多样性同时也具有潜在的医药价值。本研究在前期实验中筛选获得一株产漆酶的白腐真菌，本实验利用筛选到的真菌对一些多酚类底物尝试进行生物转化，探索其生物转化的过程，同时本实验也尝试对丹酚酸B的单体迷迭香酸进行氧化催化，探索其是否能产生有意义的二聚或多聚产物。本实验拟从通过使用菌体本身、粗酶、以及纯化酶三个层次分别探索氧化聚合过程，并且对漆酶反应的整个过程及反应条件进行调控和摸索达到最佳的催化条件，并且尝试将酶催化产物进行分离纯化，并最终确定其结构。
研究意义：直接通过化学方法进行氧化聚合反应非常困难，且会使用到大量的有机溶剂，对环境会造成破坏，而使用漆酶可以更加高效、绿色地进行氧化聚合。漆酶所需要的反应条件也是温和的。此外，漆酶反应要求较低，底物特异性较广，可作为各种工业过程的绿色催化剂。通过漆酶的氧化聚合作用可以开发具有重要药用价值的聚合物。
2. 文献综述
白腐真菌来源漆酶在氧化聚合中的催化作用
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摘 要：漆酶是一种含有多个铜离子的氧化还原酶的家族，能够催化各种芳香族化合物的氧化，伴随着氧分子被还原为水的过程。在此过程中，它在四种底物分子被氧化的催化循环中，与空气中的氧气反应，并生成唯一的副产物，水。漆酶可以使用溶解氧作为氧化源的特性引发了人们对它的深入研究。漆酶可能是最具有复杂性的酶之一，因为它们可以催化各种底物，而且它们在相对温和的条件下反应效率很高，这一特性吸引了人们对于氧化聚合物合成的关注。本文回顾了目前关于漆酶结构的知识，以及相关的催化机理。着重介绍了近年来，漆酶作为绿色催化剂的应用以及漆酶在化学和高分子材料生物合成方面的研究进展，包括该技术的一些应用，以及使用漆酶的优点、缺点和未来的工业意义。
关键词 漆酶；氧化聚合；催化；绿色
The Catalytic Role of Laccase from White Rot Fungi in Oxidative Polymerization
Abstract: Laccase is a family of REDOX enzymes containing many copper ions, which can catalyze the oxidation of various aromatic compounds, along with the process of oxygen molecules being reduced to water. In this process, it reacts with oxygen in the air in a catalytic cycle where four substrate molecules are oxidized to produce the only by-product, water. The ability of laccase to use dissolved oxygen as a source of oxidation has led to extensive research on it. Laccase is probably one of the most complex enzymes because it catalyzes a variety of substrates and is highly efficient at reacting in relatively mild conditions, a property that has attracted attention to the synthesis of oxidized polymers. The present knowledge of laccase structure and the related catalytic mechanism were reviewed. The application of laccase as a green catalyst and the research progress of laccase in chemistry and macromolecular material biosynthesis in recent years are introduced emphatically, including some applications of this technology, advantages, disadvantages and future industrial significance of using laccase.
Key Words: Laccase; Oxidative polymerization; Catalyze; Green
引言：
在过去的几十年中，氧化还原酶吸引了许多研究人员在环境和生物技术领域的研究，因为它们没有危险的副作用[1]所以很有潜力成为传统化学合成工艺的替代催化剂。普通的化学催化反应可导致所需亚结构发生不可逆的破坏，形成不需要的副产物。而在这方面，漆酶已经变得非常重要，因为它们不仅是环保的，而且所需要的反应条件也是温和的。由于漆酶的催化和电催化作用，它们在生物技术领域同样受到关注，包括食品，纺织品，化妆品，医药和纳米生物技术产业。在这些应用领域，由于漆酶广泛的底物范围，它们的使用也不断增加。漆酶催化剂直接氧化邻和对二酚、氨基酚，多酚，多胺，芳基二胺以及少数无机物离子[2,3]。一些底物不能被单独氧化，是因为它们的空间位阻或氧化还原电位较高，但它们可以被小的漆酶激活介质氧化。
1.漆酶的发现
1883年，漆酶首次被发现，起初，科学家观察到日本漆树的接触空气后，乳胶快速地硬化的现象。而漆酶是在把乳胶中这些成分分离和纯化后被命名的[4]从那以后，漆酶活性在其他植物中陆续被发现，（例如芒果，绿豆，桃子），某些原核生物和各种昆虫。在生物技术方面应用最广的漆酶主要来源于真菌[5,6]
由于真菌中的漆酶比其他物种产生的漆酶具有更高的氧化还原潜能，因此更适合在有机合成中发挥聚合作用。来自担子菌（Basidiomycetes）的白腐真菌是漆酶最主要的生产者。真菌中的漆酶具有多种生理作用，包括塑造形态、协同真菌植物 - 病原体之间的相互作用、应激防御和木质素退化[3]由于已在更高等的植物、原核生物、昆虫、真菌和地衣[7]中发现漆酶，这说明漆酶的氧化还原过程在自然界中是普遍存在的。
2.漆酶的理化性质
2.1漆酶的物理性质
在漆酶内，金属原子铜在将O2还原为H2O中发挥着关键作用。漆酶的Cu原子包括一种1型铜（Cu1），2型铜（Cu2）和3型铜（Cu3）中的两个。在漆酶催化的氧化过程中，Cu1是初级电子受体。电子接下来通过高度保守的His-Cys-His三肽转移到三核簇（TNC）中，TNC包括Cu2和Cu3原子。然后电子将O2还原为H2O[8][9]。由于Cu1在酶表面有一个宽的空腔，可以容纳一系列底物。 Cu1起到为底物电子提供入口到催化部位的作用。 同时，Cu1控制催化速率，在整个催化过程中Cu1的还原是限速的。Cu1的电位相对较低，允许电子抽象。随着从Cu1转移的四个电子，两个Cu2/ Cu3离子以三角形方式排列，促进双氧结合，导致分子氧的减少[4]。
2.2漆酶催化的聚合反应机理和条件
漆酶合成聚合物的能力已经被许多研究人员强调过了。例如被漆酶催化的苯酚的聚合及其各种衍生物可以造成聚合物有复杂的结构。而且，在有机合成过程中，基于各种底物，漆酶催化聚合了有许多的选择性强的高效反应，生成了不同的聚合物。漆酶具有优异的生物化学性质，是在有机合成时的独特替代品
如果底物是天然的，酶促反应将更加环保，因为作为催化剂的漆酶也是天然的。在最近的研究中，基于酚类的合成化学中的漆酶应用具有向于模仿自然合成代谢的能力，预测漆酶和酚类在体内合成代谢过程中[8,10]发挥的作用。天然存在的酚类合成反应被认为是漆酶的关键基质，而合成路径似乎仅仅局限于天然酚本身的氧化偶联以及它们交叉偶联形成的生物大分子。
漆酶是通常作为同工酶存在的糖蛋白，其寡聚化形成多聚体复合物。分子量范围为50到130kDa。漆酶的碳水化合物部分由甘露糖，乙酰氨基葡萄糖和半乳糖组成，范围为蛋白质质量的10％至45％。这种碳水化合物部分被认为是酶性质稳定的原因。漆酶催化四电子底物氧化，导致双氧键的还原裂解。
通常，漆酶催化酚类底物时，酚类底物松散一个电子和一个质子并把通过共振固定的苯氧基自由基转化成相应的醌结构或共价偶联低聚或聚合产品。前文已经提到了，漆酶可以促进同分子或异分子的偶联反应。在酚类或醌类系统和伯胺反应期间，会生成新的C-O，C-N或N-N产物。芳香胺主要用作漆酶催化苯酚反应的亲核试剂。被用作漆酶底物的芳香胺，在苯胺的低聚反应产生导电性或在苯胺衍生物的聚合方面也有应用。
漆酶催化性能可归因于以下三个主要步骤：（i）T1铜是通过从还原子电路接收电子减少的; （ii）电子从T1铜转移到三核T2 / T3簇; （iii）分子氧是在三核T2 / T3处激活并还原为水簇。漆酶的催化作用机理涉及四电子还原以及每个位点的二氧分子对水的影响。氧分子与血管相互作用通过2e-过程完全还原三核簇（T2 / T3）以产生含有双氧阴离子的过氧化物中间体。
2.3漆酶催化的聚合反应实例[11]
Zhou Pandeng等用真菌漆酶在缓冲溶液-有机溶剂混合体系中催化聚合 4-苯基苯酚，得到相对分子质量高、耐热性能好的灰黑色聚合物。Aktas等在水-丙酮混合溶液中利用漆酶催化聚合邻苯二酚，得到的聚合物相对分子质量为( 813 3) Da，并且该聚合物的相对分子质量分布比较窄。4-氨基苯酚为酶催化聚合的常用单体，Shan等利用辣根过氧化物酶，在二氧六环溶液中催化聚合 4-氨基苯酚，制得化学和电化学难以实现的聚合物，并且得到的聚4-氨基苯酚具有优良的电活性。
3.漆酶介导系统(LMS)
3.1 木质素
木质素是自然界中含量最丰富的植物细胞壁聚合物之一，木质素含有酚类和非酚类子单元,分别占聚合物的10%~30%和70%~90%。为了维持木素的稳定，一个环保的替代方法是生物催化，尤其是漆酶的催化，它被认为是木质素的关键活性之一。据记载，漆酶可以使木质素产生不同的改性,如聚合、解聚、Cα氧化[12]和脱甲基作用等。然而，如何通过漆酶将木质素修饰导向其中一种修饰，目前还不是很清楚。因此，为了使漆酶在维持木质素稳定过程中得到有效的应用，更好地了解漆酶如何控制木质素的改性具有重要的意义。
3.2漆酶
漆酶，是一种将分子氧还原与多种芳香底物的单电子氧化结合的氧化酶。最强大的漆酶是由白腐真菌产生的，其氧化还原电位可达800mV vsNHE.3。为了研究木质素漆酶的活性，区分木质素中的酚类和非酚类的子单元是很重要的。漆酶可以直接氧化酚醛亚基，因为其氧化还原电位足够低。相比之下，非酚醛部分具有高达1500mv vs NHE的氧化还原电位，因此，仅用漆酶难以氧化。然而，当漆酶与介质结合时，非酚醛木质素结构也可能被氧化。在这种漆酶/介质体系(LMS)中，介质首先被漆酶氧化，然后通过电子转移(ET)或自由基氢原子转移(HAT)等不同机制氧化非酚类底物。需要非酚类木质素18作为LMS亚基的酚类的氧化单元，且仅可由漆酶氧化。研究木质素改性的LMS主要集中在反应性非酚类木质素单元,14。然而，由于木质素也含有相当数量的酚亚基，了解这些亚基在与LMS孵育时如何反应是很重要的。漆酶转化木质素的研究和LMS通常使用木质素模型化合物进行。酚醛木质素模型化合物已被使用，但最常在没有介质的情况下使用。虽然得到了聚合度的结论，但无法对最初形成的反应产物的结构提供理论上的支持。因此，目前还不清楚LMS是如何修饰木质素的酚亚基，以及在何种程度上介导了这种修饰。
3.3 漆酶介导系统
漆酶介导系统(LMS)已经广泛研究了木质素氧化非酚类亚基的能力。没有通过介质也可以被氧化的酚亚基,得到了相当少的关注。因此，仍不清楚中介物的存在在多大程度上影响木质素酚亚基的反应，。为了更深入地了解这一点，可以使用UHPLC-MS来研究了一种酚类木质素二聚体(GBG)的反应，GBG由来自白腐真菌的漆酶启动，单独使用或与HBT和ABTS介质联合使用。由于与GBG相比，漆酶对HBT的氧化反应较慢，所以HBT的作用可以忽略不计。漆酶和漆酶 /HBT氧化GBG的速率相当，导致了GBG的广泛聚合。相比之下，漆酶/ABTS转化GBG的速率更高，因为GBG不仅直接被漆酶氧化，还被ABTS自由基阳离子氧化，后者由漆酶迅速形成。漆酶/ABTS系统导致了GBGC的α氧化和ABTS与GBG的耦合,而不是GBG的聚合[13]。
在漆酶对GBG转化的影响上，HBT和ABTS介质存在显著差异。HBT的影响可以忽略不计，但ABTS显著地提高了GBG的转化率，改变了后续的反应途径。然而漆酶和漆酶/ HBT的繁殖导致GBG广泛的聚合,漆酶/ ABTS系统的繁殖主要导致了Cα氧化以及GBG和ABTS之间的耦合。HBT和ABTS作用最大的不同是因为，漆酶对ABTS的氧化速率要高得多。从聚合木质素推断，使用漆酶/ABTS很可能导致大量ABTS嫁接到酚醛木质素亚基上，而这种嫁接反应在漆酶/HBT上不太可能发生。因为GBG-ABTS加合物相对稳定，所以一旦ABTS接枝到酚醛木质素亚基上，则漆酶的进一步聚合受阻。介质不仅应根据其在非酚木质素亚单位中的氧化效率，而且还应依据其与酚亚单位的反应性，这些认识有助于在LMS中选择最佳的介质。下表为不同来源的漆酶与不同底物的作用及产物的优势[11]
Table1. Laccases used in combination with mediators for bio-bleaching
漆酶来源 | 介质 | 底物 | 优点 | 引用文献 |
P. cinnabarinus | HBT | Flax pulp | Decrease in kapp no. (4 U) increase in brightness (24%) | (Sigoillot et al. 2005) |
Trametes sp. | ABTS | Eucalyptus kraft pulp | 45% reduction in ClO2 usage for achieving same pulp brightness as in the control | (Bajpai et al. 2007) |
Trichoderma harzianum | No mediator | Wastewater pulp | Reduction in Kappa no. by 18.6% | (Sadhasivam et al. 2010) |
M. thermophila | Methyl syringate | Eucalyptus kraft pulp | Increase in brightness by 8.3 pointsand decrease in kappa no.by 2.7 points | (Babot et al. 2011) |
Aspergillus niveus | Xylanase pre-treatment | Eucalyptus kraft pulp Cellulose pulp | Increase in whiteness by 17.2 points and kappa efficiency of around 56% | (de Carvalho Peixoto-Nogueira et al. 2015) |
4.漆酶聚合反应的实际应用
4.1漆酶医药上的生产应用
漆酶具有合成化合物与增加抗氧化剂以及各种有价值的聚合物的潜力。Reactive oxygen species (ROS)作为人体正常代谢产生的副产品生成,也被人类的防御系统减少。然而，在氧化应激情况下，ROS的形成与细胞抗氧化能力不平衡，导致各种神经再生障碍的发生。在这种情况下，需要补充外部抗氧化剂[14]。不幸的是，临床上有效的抗氧化药物正在减少。因此，新的化合物正在不断地被化学合成和评估其增加的抗氧化潜力
酶除了在纺织染色中的应用外，由于合成染料的环保特性，染色在化妆品生产领域具有重要意义。利用植物纤维中的多酚酶催化聚合，在可见光谱中产生不同的颜色，从而精确配制需要的颜色。传统的化学染发产品往往是刺激性的和不安全的。过氧化氢(H2O2)和苯二胺是染发过程中使用最多的化学物质。它们的过敏性和致癌性可导致严重的头发损伤。漆酶可以作为替代氧化剂，代替H2O2。基于漆酶的染发是一个新兴的研究领域。将儿茶素和邻苯二酚经漆酶聚合得到深黑色聚合物，用于化妆品染发[15,16]。作者指出，催化天然苯酚聚合制备高分子染发剂是一种有前途的、可应用于化妆品工业的绿色技术过去几年，氧化还原酶在这些领域的重要性从作为高效催化剂注册的专利数量的增加中得到了进一步强调[17]。
5.结论
漆酶在工业上具有广泛的生物技术应用价值。此外，漆酶反应要求较低，底物特异性较广，可作为各种工业过程的绿色催化剂。而漆酶在有机合成中的应用，可以开发具有重要药用价值的化合物以及聚合物，是未来可持续化学发展道路上的一个里程碑。从功能上讲，该酶还可用于生物修复，通过氧化聚合作用从环境中去除难降解的有毒化合物。此外，改变反应条件，例如 使用天然或合成的漆酶介质也可以帮助聚合反应催化。因此，深入了解漆酶的性质，以及今后对漆酶催化生物化学反应的研究，必将为设计具有自定义特性的新型生物催化剂铺平道路。
参考文献
[1] Potdar MK, Kelso GF, Schwarz L, et al.Recent Developments in Chemical Synthesis with Biocatalysts in Ionic Liquids[J]. Molecules, 2015, 20(9):16788-16816.
[2] Fairhead M, Thony-Meyer L. Bacterial tyrosinases: old enzymes with new relevance to biotechnology[J]. N Biotechnol, 2012, 29(2):183-191.
[3] Giardina P, Faraco V, Pezzella C, et al.Laccases: a never-ending story[J]. Cell Mol Life Sci, 2010, 67(3):369-385.
[4] Su J, Fu J, Wang Q, et al.Laccase: a green catalyst for the biosynthesis of poly-phenols[J]. Crit Rev Biotechnol, 2018, 38(2):294-307.
[5] Baldrian P. Fungal laccases - occurrence and properties[J]. FEMS Microbiol Rev, 2006, 30(2):215-242.
[6] Kunamneni A, Camarero S, Garcia-Burgos C, et al.Engineering and Applications of fungal laccases for organic synthesis[J]. Microb Cell Fact, 2008, 7:32.
[7] Claus H, Decker H. Bacterial tyrosinases[J]. Syst Appl Microbiol, 2006, 29(1):3-14.
[8] Jeon JR, Baldrian P, Murugesan K, et al.Laccase-catalysed oxidations of naturally occurring phenols: from in vivo biosynthetic pathways to green synthetic applications[J]. Microb Biotechnol, 2012, 5(3):318-332.
[9] Solomon EI, Augustine AJ, Yoon J. O2 reduction to H2O by the multicopper oxidases[J]. Dalton Trans, 2008(30):3921-3932.
[10] Riva S. Laccases: blue enzymes for green chemistry[J]. Trends Biotechnol, 2006, 24(5):219-226.
[11] Sharma A, Jain KK, Jain A, et al.Bifunctional in vivo role of laccase exploited in multiple biotechnological applications[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2018, 102(24):10327-10343.
[12] Bourbonnais R, Paice MG, Freiermuth B, et al.Reactivities of various mediators and laccases with kraft pulp and lignin model compounds[J]. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(12):4627-4632.
[13] Hilgers R, Vincken JP, Gruppen H, et al.Laccase/Mediator Systems: Their Reactivity toward Phenolic Lignin Structures[J]. ACS Sustain Chem Eng, 2018, 6(2):2037-2046.
[14] Chen X, Guo C, Kong J. Oxidative stress in neurodegenerative diseases[J]. Neural Regen Res, 2012, 7(5):376-385.
[15] Jeon JR, Kim EJ, Murugesan K, et al.Laccase-catalysed polymeric dye synthesis from plant-derived phenols for potential application in hair dyeing: Enzymatic colourations driven by homo- or hetero-polymer synthesis[J]. Microb Biotechnol, 2010, 3(3):324-335.
[16] Bertrand T, Jolivalt C, Briozzo P, et al.Crystal structure of a four-copper laccase complexed with an arylamine: insights into substrate recognition and correlation with kinetics[J]. Biochemistry, 2002, 41(23):7325-7333.
[17] Kunamneni A, Plou FJ, Ballesteros A, et al.Laccases and their applications: a patent review[J]. Recent Pat Biotechnol, 2008, 2(1):10-24.
3. 设计方案和技术路线
研究方案
1.在30℃，160rpm条件下，通过PDA液体培养基获得大量白腐真菌菌体
2.对获得的菌液进行过滤分离，分别获得上清和菌体。
4. 工作计划
第一阶段 1~2月 查阅漆酶氧化聚合相关文献；
第二阶段 3月 菌体的培养，粗酶液的制备和纯化；
第三阶段 4月 漆酶反应体系的构建和反应底物的筛选；
5. 难点与创新点
直接通过化学方法进行氧化聚合反应非常困难，且会使用到大量的有机溶剂，对环境会造成破坏，而使用漆酶可以更加高效、绿色地进行氧化聚合。本研究在前期实验中筛选获得一株产漆酶的白腐真菌，本实验利用筛选到的真菌对一些多酚类底物尝试进行生物转化，探索其生物转化的过程，同时本实验也尝试对丹酚酸B的单体迷迭香酸进行氧化催化，探索其是否能产生有意义的二聚或多聚产物。
