1. 研究目的与意义
【研究内容】1．明确Wnt/β-catenin信号通路通过哪种TCF抑制LDH-A1.1 体外培养HSC，设置control、control siRNA、TCF1 siRNA、TCF3 siRNA、TCF4 siRNA组，检测TCF1、TCF3、TCF4的mRNA和蛋白表达，以验证siRNA的转染效率；1.2体外培养 HSC，设置 control、Wnt3a、Wnt3a TCF1 siRNA、Wnt3a TCF3 siRNA、Wnt3a TCF4 siRNA组，检测LDH-A 的mRNA和蛋白表达，以明确TCF对LDHA的调控作用。
2. 研究千层纸素A如何通过TCF抑制LDH-A来抑制 HSC糖酵解体外培养 HSC，设置Ctrl、Wnt3a、Wnt3a LDHA siRNA、Wnt3a 千层纸素A四组，检测如下指标：2.1 检测葡萄糖摄取；2.2 检测葡萄糖消耗2.3 检测生成乳酸2.4 检测细胞内HK2、PFKP、PKM2含量2.5 检测LDH-A的mRNA表达2.6 检测细胞内LDH-A含量以明确千层纸素A通过影响TCF信号抑制LDH-A进而抑制 HSC糖酵解。
【研究意义】慢性肝病是严重威胁人类生命健康的常见疾病，在我国慢性肝病的发病率远高于发达国家。
2. 文献综述
糖酵解在肝星状细胞中的功能与意义黄天麒1，张峰1，郑仕中11江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，南京中医药大学，南京 210023摘要：肝星状细胞（HSC）是肝脏分泌细胞外基质的主要细胞，在肝纤维化的发展机制中占有重要的地位。
而肝星状细胞的能量代谢则依赖糖酵解这一途径。
催化糖酵解反应的一系列酶存在于细胞质中，因此糖酵解全部反应过程均在细胞质中进行。
3. 设计方案和技术路线
【研究方案】1．明确Wnt/β-catenin信号通路通过哪种TCF抑制LDH-A1.1 体外培养HSC，设置control、control siRNA、TCF1 siRNA、TCF3 siRNA、TCF4 siRNA组，检测TCF1、TCF3、TCF4的mRNA和蛋白表达；1.2 体外培养 HSC，设置 control、Wnt3a、Wnt3a TCF1 siRNA、Wnt3a TCF3 siRNA、Wnt3a TCF4 siRNA组，检测LDH-A 的mRNA和蛋白表达。
2. 研究千层纸素A如何通过TCF抑制LDH-A来抑制 HSC糖酵解体外培养 HSC，以人重组Wnt 3a细胞因子、千层纸素分别进行干预，设置Ctrl、Wnt3a、Wnt3a LDHA siRNA、Wnt3a 千层纸素A四组，2.1 试剂盒检测葡萄糖摄取；2.2 试剂盒检测葡萄糖消耗2.3 试剂盒检测生成乳酸2.4 ELISA检测细胞内HK2、PFKP、PKM2含量2.5 PCR检测LDH-A的mRNA表达2.6 ELISA检测细胞内LDH-A含量细胞培养1、复苏：把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
4. 工作计划
【研究进展】2022年2月检索文献，查阅资料，熟悉实验室并学习初步的实验技能。
2022年3月学习培养细胞，细胞换液，细胞转染，PCR检测，Western Blot等实验操作。
2022年4月进一步熟练实验操作，学习ELISA检测等实验操作。
5. 难点与创新点
【特色与创新】近年来一些研究表明，HSC是肝损伤时生成细胞外基质的主要细胞来源, 研究肝星状细胞糖酵解的最终目标是为慢性肝病的临床治疗提供思路和方法。
己糖激酶（HK）是糖酵解途径的关键酶，可以从HK的酶反应出发，通过对反应的调控来控制肝星状细胞的增殖和凋亡从而控制慢性肝病的病情。
最终产物丙酮酸，能促进线粒体氧消耗并增强其储备呼吸能力，线粒体代谢的增加与细胞体增殖和侵袭性相关。
