1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
紫花苜蓿是世界上栽培面积最广泛的豆科牧草之一，产量高，品质好，素有牧草之王之称。紫花苜蓿中的碳水化合物以糖类、淀粉、纤维素、半纤维素、木质素为主，是一类重要的能量营养素，在动物口粮中占有相当大的比例。影响紫花苜蓿营养价值的因素很多，包括气候、品种、产区、栽培管理、收获期、加工方式等等。张静等对不同刈割期紫花苜蓿产量及营养分析显示：不同刈割期紫花苜蓿的产量差异极显著（P0.01），第一茬最高为7473.8kg/hm2，第三茬3827.9kg/hm2，第二茬2316.2kg/hm2。粗蛋白（CP）含量随刈割时期顺序变化呈下降趋势，第三茬与第一茬、第二茬差异极显著（P0.01）。酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）含量随刈割时期顺序变化呈上升趋势，不同刈割期期间差异极显著（P0.01）。刘立成等研究了不同收割期对苜蓿青干草粗蛋白质和粗纤维含量的影响，结果显示，始花期刈割的苜蓿粗蛋白质含量极显著高于盛花期和结荚期(P0.01)，而粗纤维含量则极显著低于盛花期和结荚期(P0.01)。Menke等建立并发展了体外产气法评定饲料营养价值，发现产气量与饲料在瘤胃中的降解率呈显著正相关，科学家们已经成功地用体外发酵法评估饲料的消化性、采食量以及动物生长速度。这种方法大大地提高了饲料评定效率，降低了试验费用，而且试验条件更易控制，以获得精确一致的数据。
参考文献
[1]董宽虎,沈益新.饲草生产学[M].中国农业出版社.2003.7
2. 研究的基本内容和问题
近年来，随着我国养殖业的蓬勃发展，养殖数量和养殖技术的不断提高，大量粗饲料被用于反刍动物日粮中，但我国粗饲料品质较差，优质粗饲料短缺，对优质粗饲料如苜蓿的需求量大。而目前反刍动物日粮所需的苜蓿大都依赖于进口，使得养殖成本不断增加。我国苜蓿资源丰富，但各地区、品种的苜蓿品质不一，不同地区以及不同品种的紫花苜蓿营养价值也有所不同。同时，紫花苜蓿的生长发育及产量形成受其当地的气象条件影响很大。本试验利用体外发酵技术研究紫花苜蓿的瘤胃体外发酵特性，同时客观的比较不同刈割时间苜蓿的营养特性，为生产中合理利用紫花苜蓿资源提供技术参数。
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法
①物理化学法进行发酵底物（苜蓿样品）的制备。
②体外发酵法进行体外消化率测定。
③气相色谱法进行甲烷测定。
④Weathburn方法测定NH3-N浓度；MCP 浓度的测定参照Makkar等的方法。
⑤常规实验法进行样品营养价值的分析和DMD的测定。
3.2技术路线
1取得采集的苜蓿材料分为5组。
2配制瘤胃微生物培养液，置于39℃恒温水浴箱中恒温培养。
3将样品加入发酵瓶中，反应48h。
4培养期间分别在6，9，12，18，24，30，36， 48 h，60h，72h，84h,96h时测定并记录体外发酵产气量。
5发酵96h，终止发酵测定PH值，立即采样保存在-20℃，进行各项指标的测定。
6利用气象色谱测定VFA和甲烷、酶标仪测定MCP和氨态氮。
7样品的常规营养指标的分析以及干物质消失率。
3.3实验方案
3.3.1 实验材料
试验选取不同刈割时间的苜蓿，在实验前烘干粉碎过20目筛（1mm），各底物分别装进标记好的自封袋内，待用。称取1g（10.005g）烘干粉碎的样品于每个发酵瓶（洗净并烘干）中，标记。
3.3.2培养基的制备 参照Theodorou(1994)使用的培养基（由Van Soest改进）进行配制。按下述顺序和比例配制瘤胃微生物培养液：500ml蒸馏水→0.1ml溶液A→200ml溶液B→200ml溶液C→1ml刃天青溶液→用CO2饱和保存于39℃恒温水浴箱中5-6h→40ml还原剂溶液E→混匀，用CO2饱和，并加热至39℃→继续通CO2约0.5-1h，接种现采集的瘤胃液。整个过程均需严格厌氧。 |
3.3.3瘤胃液的采集
瘤胃液采自南京农业大学动物房去势山羊，利用负压原理用塑料吸瓶通过瘤胃瘘管抽取瘤胃内容物，保存39℃预热并充满二氧化碳的塑料瓶内，置于39℃保温杯中，并迅速带回实验室，经搅拌后四层纱布过滤，过滤后的瘤胃液用来接种。在获取瘤胃液以及处理瘤胃液的整个过程均需要严格厌氧。
3.3.4 苜蓿常规养分分析以及体外发酵试验及各项发酵液指标的测定。
3.3.4.1 常规养分指标
利用概略养分分析法测定苜蓿干物质（DM）、灰分(Ash)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)；
3.3.4.2 发酵液指标
产气量、甲烷（CH4）、pH、挥发性脂肪酸（VFA）、微生物氮（MCP）、氨态氮（NH3-N）、干物质消失率（DMD）、中性洗涤纤维消失率（NDFD）、酸性洗涤纤维消失率（ADFD）。
产气量测定参照Theodorou等方法：平衡瓶内气压，39℃培养，将分装好的发酵瓶至于39℃的恒温水浴箱中恒温培养96h，培养期间分别在6、9、12、18、24、30、36、48、60、72、84、96h测定并记录体外发酵产气量，培养结束，用冰浴停止发酵，进行采样。
甲烷（CH4）的测定：参照胡伟莲等（2006）气相色谱法。仪器及相关参数如下：GC-14B型气相色谱仪（日本岛津），毛细管柱，柱温80℃，汽化室100℃，氢离子火焰检测器检测温度120℃，载气为氮气，压力为0.05Mpa，氧气压力0.05MPa，灵敏度（档）为10-1，衰减3.0。在测完产气之后，使用微量进样器从发酵瓶内抽取5ul气体打入进样器内，及时调整时间和电压，记录峰面积值。
pH的测定：终点时冰浴终止发酵，立即测定pH。
挥发性脂肪酸（VFA）测定：取瘤胃液样品5 mL加25%偏磷酸和巴豆酸(内标法，100mL溶液中含巴豆酸0.6464g)混合液1mL，-20℃冰箱保存。测定前解冻，12000r/min离心10 min，取上清液0.6mL测定。优化张磊和邵涛的方法测定VFA，柱温130℃，进样器温度为180℃，检测器温度为180℃。高纯氮总流量30.2mL/min，柱流1.7mL/min，氢气流量40mL/min，空气流量400mL/min。
氨态氮（NH3-N）浓度测定：将样品与0.2mol/L盐酸等体积混合，于-20℃保存。测定前解冻，于4℃条件下，10000r/min离心10min，取上清液采用比色法进行测定分析。
微生物蛋白（MCP）测定：-20℃冻存的样品室温下解冻，取3mL样品1000r/min离心8min，除去原虫和饲料残渣。2mL上清液25000r/min离心20min。100L上清液加入到5mL考马斯亮蓝溶液中，在595nm波长下读取吸光度值。以结晶牛血清白蛋白为标准品，制作标准曲线。
干物质消失率（DMD）、中性洗涤纤维消失率（NDFD）、酸性洗涤纤维消失率（ADFD）；
发酵干物质消失率（DMD）的测定：发酵液(50ml离心管)于10000r离心机离心5min，弃上清液，将沉淀转移到相应标记的坩埚中在105℃烘箱中烘12h后称重。DMD（%）=（放入发酵瓶底物的量*DM%-发酵残渣的DM量）/放入发酵瓶底物的量*DM%
中性洗涤纤维消失率(NDFD)、酸性洗涤纤维消失率（ADFD）的测定：采用Van Soest等方法，配制中性洗涤剂和酸性洗涤剂分别测定发酵前后扬麦14秸秆的NDF、ADF，计算NDFD、ADFD。
3.4可行性分析
本项目的研究工作将在动物科技学院消化道微生物研究室进行，本实验室致力于消化道微生物、消化道健康及微生态制剂的研究和研发，主持承担国家自然科学基金重点项目和重大国际合作项目。积极开展国际合作与交流。本实验室在国际上率先利用分子生物学指纹技术研究动物肠道微生态，拥有能全面分析胃肠道各类微生物菌群多样性、数量定量和功能基因分析的整套分子生物学技术，同时拥有微生物厌氧培养和厌氧发酵技术，以及动物瘘管、活体测甲烷等技术体系。本实验室仪器设备先进齐全，技术力量强，可完全满足本实验对仪器设备的要求。
4. 研究创新点
体外发酵技术发酵条件一致，发酵时间一致；能够准确测定发酵产物的产量，试验费用低，因而体外消化法在反刍动物上的应用研究范围较广。本实验采用体外产气技术研究紫花苜蓿的瘤胃体外发酵特性，同时客观的比较不同刈割时间苜蓿的营养特性，为生产中合理利用紫花苜蓿资源提供技术参数。
5. 研究计划与进展
5.1研究计划
2013.10-2013.11 查阅文献，试验准备；
2013.12-2014.1 苜蓿样品收集与预处理；
