1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
猪链球菌新血清型CZ130302菌株毒力相关蛋白ChzM-TolA的功能研究
猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原，属于革兰氏阳性、兼性厌氧型球菌。SS不仅可以引起猪的败血症，侵害其中枢神经系统和其他组织，引发脑膜炎、肺炎、心内膜炎和关节炎[1-3]等各种炎性反应，还可引起人的化脓性关节炎和中毒性休克综合症[4-5]，给我国养猪业和公共卫生安全构成重大威胁，是引起公共卫生安全问题的重要病原之一。
按照荚膜抗原的血清学分类，目前共有35个猪链球菌的血清型(1-34型和1/2型)，此外还存在不属于现有血清型的菌株。CZ130302菌株[6]是在2013年江苏某猪场大量患病死亡仔猪脑组织中分离培养获得的一株细菌，通过生化鉴定，结合16S rRNA基因[7]和谷氨酸脱氢酶基因(gdh)的测序鉴定，确定该细菌为猪链球菌。电镜观察CZ130302株有荚膜结构，经过参考血清的凝集试验和多重PCR分型鉴定方法进一步确定该分离株不属于现有的任一血清型。目前为止，猪链球菌毒力因子的研究大都集中于SS2[8]，新血清型CZ130302株的研究甚少，因此，本项目拟以50K毒力岛上的单个基因为研究对象，研究新血清型CZ130302株的毒力相关基因。该基因为猪链球菌CZ130302基因组50K毒力岛的一段特殊序列，位于开放阅读框ORF1063的位置，其碱基序列在902805起始，至905156终止，该基因编码783个氨基酸的假设蛋白。通过ChzM-TolA基因编码的假设蛋白ChzM-TolA与NCBI数据库中其他菌种的功能性蛋白比对发现，该假设蛋白与肺炎链球菌（S.pneumoniae）TolA[9]蛋白(cell envelope integrity inner membrane protein TolA)同源性高达60%，与鼠链球菌（S.mitis）FBPS[10-14]纤连蛋白(Fibrinogen blinding protein)同源性高达68%，而TolA和鼠链球菌FBPS纤连蛋白均为致病性蛋白，特别是鼠链球菌纤连蛋白FBPS具有Fn结合活性，在鼠链球菌的感染中发挥着关键的作用，所以猜测该基因为毒力相关基因，编码的蛋白为毒力相关蛋白，即ChzM-TolA蛋白可能是新血清型猪链球菌株CZ130302感染吸附过程中一个重要的参与蛋白。因此，本文中命名该基因为ChzM-TolA，其编码的蛋白为ChzM-TolA蛋白。
2. 研究的基本内容和问题
1.1研究目标
成功构建△CZ130302-ChzM-TolA缺失株，通过动物试验对其毒力变化进行分析、通过细胞黏附试验对其黏附定植能力进行分析，验证该基因与毒力相关；成功构建重组表达载体PET-28a-ChzM-TolA，在大肠杆菌中实现高效表达，并对纯化产物进行免疫学实验，对其重组目的蛋白ChzM-TolA进行功能探究，从而为猪链球菌新血清型CZ130302菌株的致病机理研究提供参考。
1.2研究内容
3. 研究的方法与方案
2.1 研究方法
根据文献报道，本研究拟通过融合PCR方法实现对ChzM-TolA目的基因的无痕缺失，通过BALB/c小鼠攻毒试验测定△CZ130302-ChzM-TolA缺失株的半数致死量(LD50)和致死率(攻毒剂量2107CFU/只)；通过人喉癌上皮(HEp-2)细胞、小鼠脑内皮(bEnd.3)细胞的黏附试验测定缺失株黏附定植能力的变化，从而探究目的基因与毒力的相关性。并利用目前应用比较成熟的原核表达系统pET-28a实现目的基因在大肠杆菌中的高效表达，纯化表达产物，通过ELISA、Western blot等免疫学试验进行的重组目的蛋白的功能分析。
2.2 技术路线
4. 研究创新点
猪链球菌新血清型CZ130302菌株为2013年在江苏常州某大型猪场分离到的新型菌株，关于该菌株毒力岛和毒力因子的研究相对较少，致病机理尚不明朗。
本课题所研究的目的基因为50K毒力岛中的基因片段，目前尚未有文献报道，通过目的基因编码的假设蛋白与NCBI数据库中其他菌种的功能性蛋白的比对，发现该假设蛋白与肺炎链球菌TolA蛋白同源性高达60%，与鼠链球菌FBPS纤连蛋白同源性高达68%，而TolA和鼠链球菌FBPS纤连蛋白均为致病性蛋白，特别是鼠链球菌纤连蛋白具有Fn结合活性，在鼠链球菌的感染中发挥着关键的作用，所以猜测该基因为毒力相关基因，编码的蛋白为毒力相关蛋白。即ChzM-TolA蛋白可能是新血清型猪链球菌株CZ130302感染的吸附过程中的一个重要的参与蛋白。
该课题的研究旨在为猪链球菌新血清型CZ130302菌株致病机理的研究提供参考、奠定基础。
5. 研究计划与进展
2016年09月2016年10月 查阅相关文献，着手进行课题相关基础知识的学习和积累，完成毕业论文选题；熟悉实验室，熟练掌握常用仪器的使用规范，常规实验操作方法。
2016年10月2016年11月 进行实验设计，完成开题报告。
2016年11月2016年01月 构建△CZ130302-ChzM-TolA缺失株，并进行动物实验和细胞实验以进行野毒株与缺失株毒力强弱对比，从而验证该基因与毒力的相关性。
