1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
衰老（Senescence）是生命体中重要的生理阶段之一。植物中亦存在衰老现象，是植物发育过程适应环境所表现出的生理状态，研究植物叶片衰老具有重要的生物学意义，也是生命科学及植物生理学中研究的核心问题。叶片衰老，参与生物圈中能量转化和重要的碳循环途径，是植物叶片发育的最终阶段，是植物自主程序化细胞死亡（PCD）的结果。
叶片衰老是植物叶片发育的最终阶段，其对植物体内的营养物质循环再利用以及能量循环具有重要生理意义。叶片衰老会大幅度影响饲草的产量和品质，影响动物的养殖性能。各种内外因素都会影响叶片衰老进程，逆境下会导致植物叶片早衰，影响激素、叶绿素、蛋白质、核酸等大分子物质的代谢过程，促使其降解。目前饲草植物叶片衰老过程中的有待研究，进一步明晰叶片衰老中的调控途径，对饲草植物的品种改良和种质创新具有重要意义。本文着眼于叶片衰老调控的研究进展，就植物叶片衰老调控对饲草产量和品质的影响进行综述。
2. 研究的基本内容和问题
（1）研究目标：
明确植物特别是饲草中调控叶片衰老的分子机制。
3. 研究的方法与方案
（1）研究方法：
1.克隆LpMIEL1全长基因；进一步在酵母系统内验证LpNAL和LpMEIL1之间是否存在互作。
2. 构建BiFC和Co-IP载体系统。
3.利用烟草瞬时表达系统，开展Co-IP实验，验证LpNAL和LpMEIL1之间是否存在互作。
4. 利用黑麦草原生质体转化系统，验证LpNAL和LpMEIL1之间是否存在互作。
1. 目的片段克隆：从多年生黑麦草转录组数据库中调取目的基因全长基因序列，引物由安徽通用生物科技公司合成。装有引物干粉的离心管在室温下，转速12000RMP，离心2分钟，向其中添加对应体积的灭菌ddH2O调至10μM，用蜗旋仪震荡充分，微离心后，保存在-20度冰箱中。按要求配制高保真PCR反应体系。
2. 双酶切PCR产物：
按下表配制40ul的反应体系
| 10×ReactionBuffer | 4ul |
| 限制性内切酶1 | 1ul |
| 限制性内切酶2 | 1ul |
| PCR产物/pEDN-Linker | 30ul |
| ddH2O | 4ul |
| Totle | 40ul |
在冰上依次加入以上成分，混合完全，在37度条件下，反应2个小时。
凝胶电泳及酶切产物回收方法同上。
3. 目的片段和入门载体的连接和转化,重组法构建载体：
按下表配制10ul的反应体系
| 10×T4Buffer | 1ul |
| pEND-Linker | 1.5ul |
| 酶切产物 | 5ul |
| T4 ligase | 1ul |
| ddH2O | 1.5ul |
| Totle | 10ul |
在冰上依次加入以上成分，混合完全，在16度条件下，反应2个小时。
重组质粒化学法转化大肠杆菌方法同上。
4.制备黑麦草原生质体
1、取多年生黑麦草第一片完全展开叶片，在灭菌的ddH2O中清洗两次，用灭菌吸水纸吸干叶片表面水分（黑麦草在生长过程中，避免受到生物和非生物胁迫，水肥得当，选取黑麦草第一个肥厚、鲜嫩的完全展开叶片）。
2、按材料与方法中步骤配制酶解液，置于黑暗处待用。
3、在超净台上，切掉叶片的叶尖和叶柄，用手术刀片将叶片切割成2mm左右的碎片。按照这种方法，取25个叶片，切碎后放在盛有酶解液的方皿中。
4、将方皿置于黑暗真空条件下，处理30分钟，使酶解液和叶片充分混合。
5、在25度条件下，将方皿放置在转速40RMP的水平摇床上，酶解3个小时左右（当酶液变绿时，使用正置显微镜观察原生质体完整度）。
6、超净台中，用灭菌的尼龙网过滤酶解液于50ml离心管中，酶液在含有35-75um尼龙膜的灭菌器过滤，室温下，100g离心力，离心3分钟。
7、用移液器小心地去除上层清液，将20ml灭菌的W5溶液添加到50ml离心管中，轻轻地悬浮原生质体，室温条件下，以100g离心力，离心3分钟。
8、重复上一步骤。向离心管中添加15ml灭菌的MMG溶液，用移液器轻轻地悬浮原生质体，室温下，100g离心力，离心3分钟。
9、小心去除上清完全，向离心管中添加8ml的MMG溶液悬浮，插在冰上静置30分钟，在此期间用血细胞计数器在光学显微镜下计数视野内的数目，统计原生质体浓度，用MMG溶液将浓度调节到2-5×105细胞/ml，原生质体制备完成，可保存在4度冰箱中一周。
（4）可行性分析：
本课题所使用的实验材料为高品质的草坪草种多年生黑麦草（Loliumperenne L.），保证了该课题有足够的优质材料可供选择；
在实验室已有的实验基础上等进行实验(通过Y2H、BiFC、Co-IP三种方法验证蛋白互作等），本课题具有充分的科研依据；
此外，课题开展所在的南京农业大学草业学院“草坪草逆境生理生化和分子生物学实验室”，多年来一直从事草坪草逆境生理和分子生物学研究，在针对草坪草指标检测方面具备所需的各种仪器设备，并在精度、灵敏度和准确性上均达到课题研究的要求，完全能够支持本课题的顺利完成，所以，本课题具备丰富的硬件资源。
同时，南京农业大学白马实验基地可为本课题提供充分的场地资源，可为该实验提供各类机械、设备，如自动喷灌系统等，为本课题的顺利进行提供了有力保障。
以上资源为本课题的实施提供了所需要的所有仪器、设备和环境条件，为本课题的顺利进行提供了有力保障。
4. 研究创新点
（1）LpNAL是一个转录抑制子，其基因功能迥异于其模式植物中的相近同源基因，是调控黑麦草叶片早期衰老进程的新基因，研究对象独特。
（2）本课题应用BiFC、Western blot、蛋白纯化和 Co-IP等技术，能够较为准确的判断两个蛋白之间是否存在互作。
5. 研究计划与进展
10-11月确定课题方向，并梳理论文大纲
12-2月查阅文献资料，初步确定论文方案
3-4月提出论文修改方案，确定改写综述方案
