1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1本课题的意义小麦是世界上最广泛种植的作物，它是世界上占35-40%人口的主要粮食作物，也是我国居民最重要的口粮之一。随着科技的进步和育种水平的提高，选育高产、稳产、优质、抗病的新品种成为小麦育种的重要目标。但是在现代农业中，由于长期定向遗传改良，普通小麦品种之间遗传差异较小，遗传基础狭窄，遗传多样性丢失比较严重。遗传多样性的丢失不仅使普通小麦对生物性和非生物性的环境胁迫变得脆弱，同时也限制了小麦产量的大幅度提高和品质的进一步改良。为了提高栽培小麦的产量和抗性，拓宽其遗传基础是非常重要的。簇毛麦(Haynaldia villosa ,2n = 14 , VV)属于禾本科(Gramineae)，小麦族(Triticeae)小麦亚族(Triticum)，簇毛麦属( Haynaldia Shar. )，是小麦的一个野生近缘种。它不但抗小麦白粉病[1，2]、叶锈病、秆锈病、梭条花叶病、全蚀病、眼斑病等[3-5]，而且还具有分蘖力强、小穗数多、耐旱、抗寒以及籽粒蛋白质含量高等优良性状[6,7]，是小麦品种改良的优良基因源。为了将簇毛麦的这些优异基因导入普通小麦，前人已成功地将簇毛麦染色体通过合成双二倍体、异附加系、异代换系、易位系等方式导入到普通小麦栽培品种中。目前，利用这些染色体工程材料，已经将簇毛麦的部分优异基因定位在其特定的染色体上，其中簇毛麦6V染色体长臂已经发现有抗孢囊线虫病基因、抗小麦条斑病毒病（WSMV）的传媒瘿螨基因、抗秆锈病新小种Ug99的基因、抗菲利普孢囊线虫基因H.filipjevi等[8-11]。本研究根据定位于小麦第6部分同源群上的EST序列设计引物，开发6V染色体长臂的特异性标记，研究结果将为筛选涉及簇毛麦6V染色体长臂的小片段易位系、6V染色体所携优异基因的物理定位和抗包囊线虫病、抗白粉病以及抗秆锈病新种质的创制奠定基础。1.2国内外研究概况簇毛麦有益基因导入小麦，大都是以双二倍体为中间材料，通过杂交及回交，以及组织培养等途径获得异附加系、异代换系及易位系实现的。为了发掘、利用和更精细地定位簇毛麦6V染色体长臂上所携有的抗病基因，也迫切需要创造出更丰富的携有簇毛麦6V染色体长臂不同区段和片段大小不同的新的染色体结构变异体。虽然，目前已经获得了小麦-簇毛麦6VL/6AS补偿性易位系，但是很少有成功培育涉及簇毛麦6V染色体长臂的小片段易位系，尤其是中间插入易位系。通过硬粒小麦-簇毛麦双二倍体花粉辐射诱导染色体发生结构变异体的技术体系，已获得少量涉及簇毛麦6V染色体长臂的片段更小的顶端易位、小片段中间插入易位和染色体缺失。为了确定外源染色体的断点位置和片段长度以及易位所涉及的小麦染色体，需要对外源遗传物质进行鉴定。通常对外源遗传物质的鉴定方法有形态学标记、细胞学标记、生化标记、原位杂交和分子标记。形态学标记通常数目少，多态性低，且易受环境条件的影响，需要与其他标记结合使用；细胞学标记主要包括染色体核型分析和染色体分带，核型分析往往无法区分小麦族各物种，染色体分带则受到制片技术、显带技术、小麦染色体带纹多态性等原因的制约有一定难度；生化标记则主要指同工酶和种子贮藏蛋白标记，但是发现的生化标记仍然较少，只能用于初步定位到特定染色体或染色体臂上；原位杂交技术只能检测到外源基因是否存在，不能了解被检测外源染色体的具体身份。分子标记技术则具有快速、高效、操作简单、多态性高、不受发育阶段和环境影响等多种优势，是鉴定外源染色体身份、易位染色体断点位置和片段长度的有效工具。在物种起源进化中，某个原始基因组在漫长的进化过程，由于核苷酸变化、DNA分子的缺失、重复、倒位、易位等变化，演化成互不相同但具有一定亲缘关系的染色体组，这些染色体组的各对应染色体具有部分同源性，它们的核苷酸组成和排列顺序也具有许多相似性。利用分子标记技术鉴定外源染色质，首先需要找出供体物种和受体物种之间具有多态性的分子标记，特别是染色体专化分子标记，然后利用已定位于各个部分同源群上的标记检测被导入的外源染色体或者染色体片段涉及哪个部分同源群。再根据分子标记作图资料选用该部分同源群长、短臂上不同部位的标记，检测染色体或染色体片段的大小和易位断点的确切位置。如果易位染色体涉及两个不同的部分同源群，则要用这两个部分同源群中的标记来检测，从而可以知道组成易位染色体的供体和受体染色体区段的确切身份[12]。利用对簇毛麦6V染色体长臂特异的分子标记可更准确、快速地鉴定易位染色体的组成，但是已经报道的能特异追踪簇毛麦6V染色体长臂的特异分子标记非常少。因此，本研究根据定位于小麦第6部分同源群上的EST序列设计引物，开发6V染色体长臂的特异性标记，将为筛选涉及簇毛麦6V染色体长臂的小片段易位系、6V染色体所携优异基因的物理定位和抗包囊线虫病、抗白粉病以及抗秆锈病新种质的创制奠定基础。EST (expressed sequence tags) 表达序列标签是将mRNA在体外反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库，大规模随机挑取cDNA克隆，对其5 端或3端进行一步法测序后获得的长约300-500bp的表达序列片段。EST-STS标记是直接在EST 序列两端设计引物，对基因组或者cDNA进行扩增，从中寻找与目的基因连锁或具有染色体特异性的EST 标记。EST标记除具有一般分子标记的特点外，还有其特殊优势：（1）信息量大。如果发现一个EST标记与某一性状连锁，那么该EST就可能与控制此性状的基因相关；（2）通用性好。由于EST来自转录区，其保守性较高，在家族和种属间的通用性比来源于非表达序列的标记更高。正因如此，EST标记特别适用于远缘物种间比较基因组研究和数量性状位点信息的比较。（3）开发简单、快捷、费用低，尤其是以PCR为基础的EST标记。目前，EST标记已经广泛应用于新基因的发现、种间序列的比较以及功能基因组学的研究等[13]。由于EST来自于转录区，其保守性较高，在种族和种属间的通用性比来源于非表达序列标签的标记(如SSR标记)更好，特别是适用于远缘物种间的比较基因组研究，根据EST所开发的STS标记在物种之间具有较好的通用性。研究表明[14]，以EST为基础开发的标记更容易在小麦的野生近缘物种中加以利用，更适合于亲缘关系较远的物种如黑麦（Secale cereale）、大麦（Hordeum vulgare）与小麦（Triticum aestivum）的多态性研究。曹亚萍等[15]根据作物的共线性关系，利用小麦、水稻的EST序列设计STS引物，筛选出涉及簇毛麦1V-7V染色体的13对特异标记。王春梅等[16]根据已定位于普通小麦第一部分同源群的EST序列设计104对STS引物，对中国春、鹅观草、黑麦及簇毛麦进行多态性分析，有53对在对照普通小麦、中国春与鹅观草、黑麦及簇毛麦之间存在多态性。Lili Qi等[17]应用定位在小麦4D 短臂上不同区段的106条EST序列设计STS引物，对中国春ph1b突变体和小麦中间偃麦草易位系进行PCR分析，共筛选出涉及中间偃麦草的8对特异标记。Wang等[18]根据定位于小麦2B染色体8个区域的EST序列设计了105对EST-PCR引物，结果筛选到能追踪中间偃麦草短臂和长臂的分子标记分别有7对和8对。1.3应用前景本研究根据定位于小麦第6部分同源群上的EST序列设计引物，开发6V染色体长臂的特异性标记，将为筛选涉及簇毛麦6V染色体长臂的小片段易位系、6V染色体所携优异基因的物理定位和抗包囊线虫病、抗白粉病以及抗秆锈病新种质的创制奠定基础。
参考文献：
1. 刘大钧,陈佩度,裴广铮. 将簇毛麦种质转移给小麦的研究 [J]. 遗传学报，1983，10(2): 103-113.2. 董玉琛,郑殿升.中国小麦遗传资源[M].北京,中国农业出版社,2000,6:32-33.3. Qi L L, Cao M S, Chen, P D, Li W L, Liu D J. Identification, mapping and application of polymorphic DNA associated with resistance gene Pm21 of wheat [J]. Genome,1996, 39:191-197.4. Cao A Z, Wang X E, Chen Y P, Chen P D. A sequence-specific PCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosome 6AS, 6BS, 6DS of Triticum aestiyum and 6VS of Haynaldia villosa. Plant Breeding, 2006, 125: 201-205.5. 曹亚萍,曹爱忠,王秀娥,陈佩度.基于EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用[J].作物学报, 2009, 35(1): 110.6. 王春梅，冯祎高，庄丽芳，曹亚萍，亓增军，别同德，曹爱忠，陈佩度.普通小麦近缘物种黑麦1R、簇毛麦1V及鹅观草1RK1染色体特异分子标记的筛选.作物学报，2007，33（11）：1741-1747.7.李桂萍，陈佩度，张瑞奇，王春梅，曹爱忠，张守忠.小麦-簇毛麦6VS/6AL易位染色体在不同小麦背景中的遗传稳定性及其在配子中传递.麦类作物学报，2007,27（2）：183-187.8. 闫乃红, 陈静, 马欣荣, 等. 小麦抗禾谷类根线虫基因 Rkn-mnl 的 SCAR 标记[J]. 2003.9. He R, Chang Z, Yang Z, et al. Inheritance and mapping of powdery mildew resistance gene Pm43 introgressed from Thinopyrum intermedium into wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2009, 118(6): 1173-1180.10. Liu C, Qi L, Liu W, et al. Development of a set of compensating Triticum aestivumDasypyrum villosum Robertsonian translocation lines[J]. Genome, 2011, 54(10): 836-844.11. 张佳佳. 小麦近缘属种对Heterodera avenae和H. filipjevi的抗性分析[D]. 河南农业大学, 2012.12. 冉玲. 小麦多年生簇毛麦异染色体系的筛选与准确鉴定[D].电子科技大学,2013.13. 陈升位,陈佩度. 簇毛麦6V染色体短臂特异性EST标记的开发及缺失定位[J]. 麦类作物学报,2010,05:789-795.14. 张伟. 簇毛麦染色体分子核型及染色体结构变异体库的构建[D].南京农业大学,2012.15. 曹亚萍,曹爱忠,王秀娥,陈佩度. 基于EST-PCR的簇毛麦染色体特异分子标记筛选及应用[J]. 作物学报,2009,01:1-10.16. 王春梅,别同德,陈全战,曹爱忠,陈佩度. 簇毛麦6V染色体短臂特异分子标记的开发和应用[J]. 作物学报,2007,10:1595-1600.17. Qi L L, Friebe B., Zhang P. Homoeologous recombination chromosome engineering and crop improvement [J]. Chromosome Research, 2007, 15: 3-19.18.Wang M J, Zhang Y, Lin Z S, Ye X G, Yuan Y P, Ma W, Xin Z Y. Development of EST-PCR markers for Thinopyrum intermedium chromosome 2Ai#2 and their application in characterization of novel wheat-grass recombinants. Theoretical and Applied Genetics, 2010, 121: 1369-1380.
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标根据定位于小麦第6部分同源群上的EST序列设计引物，开发和筛选簇毛麦6V染色体长臂的特异分子标记。
2.研究内容利用已经初步开发的簇毛麦6VL染色体特异分子标记在簇毛麦、硬簇麦、硬粒小麦、中国春、簇毛麦1V-7V二体异附加系、T6AS6VL和T6AL6VS补偿性易位系中进行扩增，其中一些多态引物对在簇毛麦、硬簇麦、6V二体附加系和T6AS6VL补偿性易位系中有明显区别于其他材料的清晰的扩增条带，可作为簇毛麦6V长臂染色体的特异分子标记。
3.拟解决的关键问题筛选到能特异追踪簇毛麦6V染色体长臂的分子标记是本研究拟解决的关键问题。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法 1.1植物材料簇毛麦(H. villosa, 由南京植物园从英国剑桥植物园引进，VV)、硬粒小麦(T. durum, 由中国农业科学院引种组从国际玉米小麦改良中心引进, 编号中引1286，AABB)、普通小麦中国春(Triticum aestivum cv. ChineseSpring, CS)、由南京农业大学细胞遗传研究所选育的硬粒小麦-簇毛麦双倍体(T. durum-H.villosa amphiploid，AABBVV)、簇毛麦1V-7V二体异附加系、T6AS6VL和T6AL6VS补偿性易位系。
1.2引物基于作物的共线性关系，利用PRIMER5.0软件，根据定位于普通小麦中国春第6部分同源群染色体短臂不同区段的EST序列设计并委托上海英俊生物公司合成所需引物。
EST序列从GRAINGENES网站中获取。
4. 研究创新点
根据定位于小麦第6部分同源群上的EST序列设计引物，开发6V染色体长臂的特异性标记，研究结果将为筛选涉及簇毛麦6V染色体长臂的小片段易位系、6V染色体所携优异基因的物理定位和抗包囊线虫病以及抗秆锈病新种质的创制奠定基础。
5. 研究计划与进展
2014年7月----2014年9月进入实验室进行各种基本实验技术的学习，掌握基本的实验操作技术及相应原理； 2014年9月----2015年5月 熟悉实验材料，提取实验材料的DNA，利用设计的分子标记对材料的DNA进行扩增，统计实验扩增结果，筛选簇毛麦6V染色体长臂特异的分子标记。
2015年5月----论文的撰写。
