1. 研究目的与意义
内容：通过生物信息学分析，柔红霉素生物合成基因dauW具有与黄素腺嘌呤二核苷酸FAD共价结合的氧化还原酶特征性结构域，因此推测DauW具有氧化还原酶的催化作用。
其次以质粒pET-32为基础，构建dauW的表达质粒。
通过IPTG诱导大肠杆菌DE3异源表达DauW蛋白，通过破碎细胞以及NTA-镍亲和柱分离纯化DauW蛋白。
2. 文献综述
附件
3. 设计方案和技术路线
研究方案：1. 通过NCBI，SWISS-MODEL等生物软件初步对DauW进行生物信息学分析；2. 设计dauW的引物，PCR扩增dauW基因，利用质粒pET-32，通过酶切连接反应，构建dauW的表达质粒；3. 通过IPTG诱导大肠杆菌DE3大量表达DauW蛋白；4. 通过细胞超声破碎，获得DauW粗蛋白液；5. 通过NTA-镍亲和柱对DauW蛋白进行分离纯化，获得DauW的纯蛋白；6. 通过Bradford法测定DauW的蛋白浓度，由于推测DauW能够和FAD共价结合，利用紫外分光光度计对纯化的DauW进行初步光谱性质的鉴定。
5.在Tris-Hcl pH7.5缓冲液中建立DauW体外酶催化体系，以来自柔红霉素出发菌的发酵产物为底物，分别添加DauW和辅因子FAD，从而建立酶反应体系；6.利用液质联用技术LC-MS，对酶反应过程进行分析，初步确定DauW的氧化还原酶的催化功能。
技术路线：附件
4. 工作计划
2022年1月2月：进行文献查阅，dauW生物信息学分析； 2022年3月：构建dauW表达质粒，大肠杆菌异源表达DauW蛋白，获得粗蛋白液；2022年4月：分离纯化DauW蛋白，测定DauW蛋白浓度和鉴定蛋白性质； 2022年5月：建立体外酶催化体系，利用液质联用，确定DauW催化功能；2022年6月：撰写毕业论文。
5. 难点与创新点
对dauW进行生物信息学分析，发现其具有能够与黄素腺嘌呤二核苷酸共价结合的氧化还原酶特殊结构域。
通过体外表达DauW蛋白进行酶催化实验，首次从dauW作为氧化还原酶的角度尝试解析dauW在整个柔红霉素生物合成途径中的作用，为将来通过分子育种进一步提高柔红霉素工业生产菌株的发酵水平提供理论基础。
