1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
高粱是世界范围内第五大重要作物，作为C4植物,有着较高的光合效率，具有生长快、产量高、耐瘠薄、耐逆等特点，素有植物中的骆驼之称，是集食用、饲用、糖用和能源为一体的多用途作物。高粱原产于非洲，在中国有着悠久的栽培历史，且适应性极广。高粱作为能源植物，有其独特的优势。此外,高粱的基因组较小，且已经完成基因组测序，有丰富的生物信息学资源，现已经成为继水稻之后又一个重要的粮食和能源模式作物[1]。
WRKY转录因子是近年来发现的植物所特有的新型转录调控因子，因在其N-端含有由WRKYGQK组成的高度保守的氨基酸序列而得名[2]。第一个被发现的WRKY转录因子是由Ishiguro等从白薯克隆得到的SPF1[3]。目前在拟南芥中共发现了七十多个WRKY成员，而且有多个证据表明它们与植物对非生物逆境激发的应激反应关系密切[4]。有研究表明WRKY转录因子具有参与应对缺磷、缺铁等缺素的生理调控的功能[5]。部分WRKY成员介导了植株应答和抵御盐分逆境信号的转导过程。WRKY转录因子通过基因转录调控机制在介导植物低磷胁迫信号的转导中发挥着重要作用[6]。
Vance等人指出植物主要通过两种策略应对低磷胁迫：对内提高磷的利用效率；对外增加磷的吸收[7]。选择合适的基因，选育磷高效基因型的作物，使得作物可以高效利用匮乏的磷素，即利用尽可能少的资源创造更多的价值,同时也可避免过量施加磷肥造成的环境污染和资源浪费，对人类可持续性发展具有重要意义。
2. 研究的基本内容和问题
高粱是重要的粮食、饲料和能源作物。磷参与植物大部分重要的生理过程，是作物生长发育所必需的营养元素,是蛋白质、核酸、氨基酸和叶绿素等的组成成分。磷的缺乏是影响作物产量的重要限制因子。然而土壤中磷浓度含量十分有限，远不能满足植物对磷含量的需求。WRKY家族转录因子具有保守的WRKY结构域，能够通过调控基因的表达在植物抵御生物和非生物胁迫过程中起重要作用。 本实验以高粱为实验材料，通过比较不同低磷处理时间后高粱的根系形态与酸性磷酸酶活等，确定合适的取材时间，提取高粱根系的总RNA，经反转录后克隆低磷胁迫响应相关的WRKY转录因子，对其序列进行生物学分析，探究低磷条件下该WRKY转录因子的表达模式，为高粱低磷胁迫响应相关WRKY转录因子的研究提供参考和依据。
3. 研究的方法与方案
主要研究方法：
1. 水培法
选取齐大小均匀的高粱种子，经70%酒精和0.1%升汞依次灭菌5分钟、10分钟，用无菌水洗涤干净后放入人工气候箱于28℃下避光萌发。种子长出约1.5厘米幼根后转入 P（1 mM KH2PO4）营养液中。待长至一叶一心时，去除胚乳，在新鲜 P营养液中培养2-3天后，分成两组。一组在 P营养液继续培养作为对照，另一组转入-P(1 μM KH2PO4)营养液中进行低磷处理。营养液起始PH值为6.00.1，每3天更换一次营养液。高粱置于12/12 h光照/黑暗、28 ℃、相对湿度为65%的培养箱中培养。
2.RNA提取方法
使用北京天根公司的RNA Plant Extraction Kit(DP419)试剂盒提取样品RNA，步骤如下：
1）取50-100 mg样品放入研钵，加入液氮快速研磨成粉状。加入1 ml裂解液RZ，匀浆后转移至离心管中。
2）室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。
3）4 ℃15000 g离心5 min。小心取上清液，转入新的离心管中。
4）加入200 μl氯仿，剧烈涡旋混匀30 g，室温静置3 min。
5）4 ℃ 15000 g离心15 min，样品分为三层：黄色有机相、中间层和无色的水相，RNA主要存在于水相，约为500 μl。将上层水相转移至新的离心管中。
6）缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，轻轻混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR中，4 ℃ 15000 g离心1 min，弃掉收集管中的废液。
7）向吸附柱CR中加入500 μl去蛋白液RD（使用前需加入乙醇），4 ℃15000 g离心1 min，弃废液。
8）向吸附柱CR中加700 μl漂洗液RW，4 ℃15000 g离心1 min，弃废液
9）向吸附柱CR中加500 μl漂洗液RW，4 ℃15000 g离心1 min，弃废
10）将吸附柱CR放入收集管中，4 ℃ 15000 g离心2 min，去除残余液体。
3. cDNA的合成
1) 在 Microtube 中配制下列反应混合液。
试剂 | 使用量 |
Oligo dT Primer (50μM) | 1 μl |
dNTP Mixture (10 mM each) | 1 μl |
模版RNA | Total RNA≤5 μg或Poly(A) RNA≤1 μg |
RNase free dH2O | 至总体积 10 μl |
2) 65℃保温 5 min 后，冰上迅速冷却。
3) 在上述 Microtube 管中配制下列反转录反应液，总量为 20 μl。
试剂 | 使用量 |
上述变性后反应液 | 10 μl |
5*PrimeScript II Buffer | 4 μl |
RNase Inhibitor (40 U/μl) | 0.5 μ l(20U) |
PrimeScript II RTase (200 U/μl) | 1 μl (200U) |
RNase free dH2O | 至总体积20 μl |
4) 缓慢混匀。
5) 42℃ 30～60 min。
6) 95℃ 5 min (酶失活)后，冰上冷却。
3. 荧光定量PCR
1）qPCR反应体系配制
试剂 | 使用量 |
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | 10.0 μl |
Primer 1 (10 μM) | 0.4 μl |
Primer 2 (10 μM) | 0.4 μl |
ROX Reference Dye 1 | 0.4 μl |
模板DNA | 2.0 μl |
灭菌蒸馏水 | 至总体积 20.0 μl |
2）qPCR反应程序设置
一般采用下图所示两步法程序进行反应，即退火/延伸设置在60℃。
程序 | 温度 | 时间 |
Stage1 预变性（Reps：1） | 95℃ | 5 min |
Stage2 循环反应（Reps：40） | 95℃ 60℃ | 10 sec 30 sec |
Stage3 融解曲线（Reps：1） | 95℃ 60℃ 95℃ | 15 sec 60 sec 15 sec |
3）反应结束后确认扩增曲线及融解曲线，进行标准曲线制作等。扩增产物特异与否也可用琼脂糖凝胶电泳进行确认。
可行性分析：
目前，拟南芥、水稻、玉米中已有低磷相关WRKY转录因子被相继报道，。高粱基因组已测序完成，通过生物信息学分析等方法，可以对高粱WRKY基因家族进行分析，并预测高粱中低磷响应相关的WRKY。
实验方案：
1. 材料处理：利用水培法对大小均匀的高粱种子进行培养，待三叶期时对其进行低磷与足磷处理。
2. 取样：分别在不同磷浓度处理后的第0天、2天、4天、6天、8天测量植株的根系形态和酸性磷酸酶活，并取适量根系擦干，用锡箔纸包好，于液氮速冻30 min后，置于-80℃冰箱备用。. RNA的 提取与cRNA的合成。
3. RNA的 提取与cRNA的合成。
4. WRKY转录因子的克隆与分析：利用生物信息学查找基因序列，设计特异性引物，进行基因克隆。
5. 分析克隆WRKY转录因子的的序列及其在低磷条件下的表达模式。
4. 研究创新点
目前，在拟南芥、水稻中已发现若干WRKY转录因子具有调节植物磷平衡的作用，而关于高粱低磷胁迫响应相关的WRKY转录因子尚未见报道。
WRKY家族转录因子具有保守的WRKY结构域，在植物抵御生物和非生物胁迫过程中起重要作用。
本实验旨在克隆高粱中参与低磷胁迫响应相关的WRKY转录因子，并对其进行初步的分析。
5. 研究计划与进展
研究计划
1. 搜集相关文献，掌握国内外研究近况、方向融合自己观点整理成文献综述。
2. 着手进行相关实验
