1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
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一、课题意义 大豆是世界上重要的粮食和油料作物，也是植食性蛋白质的重要来源，大豆蛋白质氨基酸组分齐全，但含硫氨基酸含量低，限制了大豆的营养价值。目前中国大豆生产总量以及质量还远远不能满足国内对大豆的消费需求。虽然多年来通过遗传改良的方法，已经获得一些高产、高油分、高蛋白的优良品种，但要获得持续高产高营养价值的大豆新品种，还存在很多局限。随着基因工程研究的深入，用转基因技术来改良品种已在许多作物上得到应用。通过转基因技术配合传统育种方法提高大豆的产量和品质是一种新的有效途径。在美国转基因大豆充斥中国市场的情况下，培育高产优质的自主大豆品种，已成为我国大豆育种的迫切任务，也是发展可持续农业的重要课题。大豆储藏蛋白主要包括大豆球蛋白(11S)和β-伴大豆球蛋白(7S)，由于11S和7S有着各自特殊的氨基酸组成和结构, 因此调控11S/7S比例可改善大豆蛋白营养品质和功能特性。研究表明大豆蛋白11S与7S呈显著负相关，并推断11S可能补偿7S的降低，从而保证总蛋白数量不变，但该调控机制仍不清楚。7S含硫氨基酸含量更少，特别是不含半胱氨酸。含硫氨基酸即半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met）在生物有机体的初级和次级代谢中具有尤为重要的作用。因此，降低7S含量以提高大豆含硫氨基酸的含量，已成为大豆品质改良的一个重要方向。大豆种子贮藏蛋白基因表达的调控主要发生在转录水平和转录后水平上。CRISPR/Cas9（clusteredregularly interspaced sht palindromic repeats-Cas nuclease）是第三代基因编辑技术，由CRISPR 序列与Cas9基因组成，其中CRISPR 由一系列高度保守的重复序列(Repeat)与间隔序列(Spacer)相间排列组成。在CRISPR序列附近存在高度保守的 CRISPR相关基因(CRISPR-associatedgene, Cas gene)，这些基因编码的蛋白具有核酸酶功能，可以对DNA序列进行特异性切割。利用生物工程手段改良蛋白品质即提高食用大豆含硫氨基酸的含量，有效的措施之一就是对编码β-伴大豆球蛋白(7S)基因进行遗传操作。7S球蛋白又称为β-伴大豆球蛋白，Gm7Sα是编码β-伴大豆球蛋白(7S) 的α’亚基基因。本课题利用CRISPR/Cas9技术敲除基因Gm7Sα，降低7S球蛋白的含量，提高11S/7S比例，希望从而提高大豆含硫氨基酸的含量，改良大豆的品质。 二、国内外研究概况 近些年来基因编辑技术的应用已经很普及,发展也很迅速，目前应用较广的主要基因编辑技术有3种,分别是锌指核酸酶(ZFN),类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)及规律性重复短回文序列簇[Clusteredregularlyinterspaced shortpalindromicrepeats/CR ISPR-associated (CRISPR/Cas)]。前两项技术因为其结构复杂且使用成本较高,不易操作,所以其发展受到一定的限制由于CRISPR/Cas9通过一小段RNA就可以对DNA进行识别,操作简单方便,定位精确,所以CRISPR/Cas9基因编辑技术被广泛应用在植物基因编辑中CRISPR/Cas9系统基因组序列主要由反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA,tracr RNA)序列区Cas基因序列区和CRISPR序列区三部分组成tracr RNA主要与crRNA结合,引导Cas9蛋白靶向目标序列,从而使核酸内切酶的靶向切割功能得到发挥Cas9蛋白包含2个核酸酶结构域:HNH结构域和Ruv C-like结构域HNH结构域位于Cas9蛋白氨基端,负责切割与crRNA互补配对的DNA序列,切割点位于前间区序列邻近基序(protospacer adjacentmotif,PAM)上游3个核苷酸(nucleotide,nt)处;Ruv C-like结构域则位于蛋白中间位置,负责切割另一条DNA链,切割点位于PAM序列上游3-8 nt处分析Cas9蛋白晶体结构能够让科研工作者更好、更精细地研究其作用机制,从而为CRISPR/Cas9系统的优化和应用提供了基础 11S球蛋白含硫氨基酸比较丰富，蛋白品质好，豆制品的营养价值高，而7S球蛋白富含赖氨酸，产量高，具有较高的经济效益等。7S伴大豆球蛋白中赖氨酸含量高于11S球蛋白，但7S球蛋白中不含有半胱氨酸，β亚基几乎不含蛋氨酸，与11S球蛋白相比是低含硫氨基酸蛋白质。11S球蛋白与7S球蛋白之间呈显著负相关。所以筛选获得β－伴大豆球蛋白（7S）含量减少的材料一直是研究热点。李丹等对大豆7S球蛋白结构特性与表面疏水性相关性进行研究;舒文涛等利用生物信息学软件(BIOEDIT，DNAMAN)对已在GenBank数据库中注册的大豆7s球蛋白β-伴大豆球蛋白亚基氨酸序列分析各亚基氨基酸组成、比对氨基酸序列。 三、应用前景 本实验通过将控制大豆种子发育和储藏物质形成的Gm7Sα基因敲除，使其减少表达，从而提高大豆含硫氨基酸的含量，期望得到产量、营养成分有所增加的大豆新材料，以供育种需要。
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2. 研究的基本内容和问题
| 一、研究目标 本课题利用CRISPR/Cas9技术敲除基因Gm7Sα，降低7S球蛋白的含量，提高11S/7S比例，希望从而提高大豆含硫氨基酸的含量，改良大豆的品质。 二、研究内容 本实验通过利用CRISPR/Cas9技术敲除大豆基因Gm7Sα，对遗传转化中的抗性苗进行分子鉴定（DNA鉴定、转录鉴定和蛋白组鉴定）。对鉴定得到的阳性苗进行生物学观测和生理指标测定，期望得到产量、品质有所提高的大豆新材料。 三、拟解决的关键问题 敲除后的基因是否表达及表达情况如何。 转基因植株与对照相比是否存在表型差异。
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3. 研究的方法与方案
| 一、研究方法 转Gm7Sα基因大豆材料T0代由CRISPR/Cas9载体转化农杆菌后介导大豆子叶节转化方法得来。T2代2018年6月种于江浦网室，V3期以后取叶片用于提取DNA和RNA进行检测。 DNA提取 取叶片样品于液氮中，在超低温条件下将叶片用磨样机磨碎，使用PD 生物技术有限公司购买的DNA提取试剂盒进行提取。 PCR鉴定 PCR反应体系（20ul）：2×Rapid Mix 10ul、上游引物 1ul、下游引物 1ul、模板DNA2ul、ddH2O up to 20ul。 PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸5min。 RNA提取和cDNA合成 取转基因大豆各个组织液氮中研磨，用天根购买的RNA提取试剂盒进行RNA提取。使用诺维赞反转录试剂盒将RNS反转成cDNA。RNA保存在-80℃，cDNA保存于-20℃。 RT-PCR 简述RT-PCR原理：实时荧光PCR被认为是准确、特异、无交叉污染和高通量的定量PCR方法。实时荧光定量PCR技术原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。这种方法采用一个双标记荧光探针来检测PCR产物的积累，可以非常精确地定量基因拷贝数。这项技术实现了PCR从定性到定量的飞跃。由于采用完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了其它检测方法存在的交叉污染问题。 表型观测 大田里豆荚成熟后，单株收获转基因阳性植株并对株高、节数、分枝数、单株荚数、单株粒数、单株产量、百粒重等农艺性状指标进行测定 品质指标测定 对收获种子的水分、蛋白含量、油分含量、淀粉含量等品质指标进行测定
二、技术路线
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4. 研究创新点
| 大豆转基因效率不高，我们是首次将Gm7Sα基因从大豆品种Jack中敲除，获得了较多的转基因阳性植株进行下一步的研究。 |
5. 研究计划与进展
| 一、研究计划: 2018.6-2018.7 转基因大豆在江浦中间试验网室中种植； 2018.8-2018.9 转基因大豆组织取样，DNA提取，基因检测，载体检测，启动子检测； 2018.10-2018.11 转基因大豆收获和拷种 2018.12-2019.1 转基因种子品质相关指标的测定。 2019.1-2019.3 RNA提取，组织表达分析 2019.3-2019.4 数据处理，准备论文撰写 二、预期进展: 1、基因组DNA的提取和质量的完成 DNA提取完成后，选择部分样品取4ul用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，检测结果电泳条带颜色明亮，条带整齐均一，提取的DNA质量较好，可用于下一步的检测实验。 2、T2代植株的PCR检测完成 取10μlPCR反应液用1%琼脂糖凝胶进行电泳，结果质粒条带明亮，大小在633bp左右，阴性对照没有条带，说明扩增过程无污染。各样品的目的条带均一，颜色鲜亮，并且与阳性对照大小一致。在大豆遗传转化中，T-DNA插入的是基因组的单链中，所以低世代的转基因植株会发生分离，所以来自同一株系的不同后代出现转基因植株和非转基因植株，经过逐代鉴定选择性淘汰非转基因植株，高世代的转基因植株会逐渐趋向纯合。 3、RNA提取和RT-PCR完成 RNA提取和质量检测：提取样品的总RNA后，取2uLRNA用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结果显示条带为均一、鲜明的三条带，无DNA污染，可用于下一步反转录。
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