1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
自 Alexander Fleming 于 1928 年发现青霉素( Penicillin)以来，抗生素作为一种重要的药物广泛用于医药、畜牧业和水产养殖业，并且近年来种类和数量快速增长，抗生素已经成为了现代生活的一个重要组成部分。在这期间，抗生素作为饲料添加剂在畜禽养殖业中的应用已有几十年历史，抗生素对预防、治疗动物疾病，刺激动物生长和增产起到了积极的作用。目前在全球范围内很多地区都采用抗生素来实现增加产量、提高经济效益的目的。但是，由于某些细菌在动物及人体是一致的，那么就会出现细菌在动物体内产生抗生素抗性并传给人类这样的问题。[1] 据统计，澳大利亚每年生产的抗生素 36%用于人类，8%用于兽药，56%混入饲料当中[2]；据 UCS(2001)报道，美国 2000 年16200t 抗生素的消耗中，30%用于人类，70%用于动物。1997 年德国青霉素产量为 900t[3]，1998 年丹麦抗生素总产量为87t[4]。在美国，每生产1公斤肉和蛋需要使用300毫克的抗生素[5]，而在我国，大约每生产1公斤肉和蛋需要使用900毫克抗生素，是美国用量的3倍左右，导致我国养殖业陷入病原菌耐药↑→抗生素用量↑↑→耐药性↑↑↑的恶性循环的复杂和被动的局面。 耐药性形成是细菌在环境和药物压力下通过自身DNA变异或获得外源性耐药因子的过程。低浓度抗生素可激活细菌的超氧自由基（Reactive Oxygen Species, ROS）代谢，产生低浓度的羟自由基，而使细菌处于氧化应激状态，提高细菌DNA的突变率和耐药性的产生[6]。Zhu等[7]利用宏基因组学研究了北京、嘉兴、莆田三地三个万头猪场猪粪便细菌的耐药情况，检测到149 种抗生素耐药基因，耐受抗生素的种类包括了氨基糖苷类、β-内酰胺、四环素、万古霉素，并且随着猪粪用于土壤施肥，土壤的耐药基因水平也会随之上升。张珍珍等[8]就对重庆地区规模化猪场分离出的 124 株致病性大肠杆菌进行耐药性监测发现，全部菌株均表现出不同程度的耐药性，尤其对常被广泛添加与动物饲料中的四环素和磺胺类药物的耐药率最高。本实验通过比较采食饲料前后仔猪粪便中大肠杆菌耐药性的变化，来探讨和分析大肠杆菌耐药性变化的相关原因，给予商品化猪场在降低仔猪疾病的发生率上一些帮助。
参考文献： [ 1 ] Elisabeth Meyera, Petra Gastmeiera, Maria Deja et al. Antibiotic consumption and resistance: Data from Europe and Germany [J]. International Journal of Medical Microbiology, 2013, 303:388-395: [ 2 ] Richardson BJ, Lam PK, Martin M. Emerging chemicals of concern: pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in Asia, with particular reference to Southern China [J]. Mar Pollut Bull, 2005, 50(9): 913-920 [ 3 ] Roman H. TTKK-lKH. Occurrence of antibiotics in the aquatic environment [J]. The Science of the Total Environment 1999, 225: 109～118: [ 4 ] Halling - Sorensen B. NNS, Lanzky P. F., et al. Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment - a reivew [J]. Chemosphere 1998, 36: 357～393: [ 5 ] Agerso Y, Aarestrup FM, Pedersen K, et al. Prevalence of extended-spectrum cephalosporinase (ESC)-producing Escherichia coli in Danish slaughter pigs and retail meat identified by selective enrichment and association with cephalosporin usage [J]. J Antimicrob Chemother, 2012, 67(3): 582-588 [ 6 ] Lee HH, Collins JJ. Microbial environments confound antibiotic efficacy [J]. Nat Chem Biol, 2012, 8(1): 6-9 [ 7 ] Zhu YG, Johnson TA, Su JQ, et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(9): 3435-3440 [ 8 ] 张珍珍，吴俊伟，唐建华等. 重庆市猪源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性监测 [J]. 中国兽医杂志, 2009, 45：85～87:
2. 研究的基本内容和问题
1研究目标： 1.1 以商品化的三元杂交仔猪为实验动物，研究抗生素对肠道大肠杆菌耐药应答的作用，有利于分析导致我国目前畜禽病原菌耐药性问题严重的相关原因。
2研究内容： 2.1；对采食饲料前后的健康仔猪，即7d1d，55d 1d两个时间点的仔猪采集新鲜粪便，分离，保存其粪便中的大肠杆菌 2.2；利用NLSI标准琼脂稀释法测定大肠杆菌对相关抗生素的MIC值 2.3对获得的实验数据进行分析，得出相关结果，并且分析其中的原因。
3关键问题：能正确分离、纯化和保存大肠杆菌，得到较纯的大肠杆菌属的菌株样品。能正确使用琼脂稀释法得到不同时间点的大肠杆菌的抗生素MIC值。能正确使用数据分析方法处理数据。
3. 研究的方法与方案
3.1.1选取四窝，每窝两头，共8头健康的仔猪。在日龄7d1d时，采集新鲜粪便，对这8头仔猪进行特殊标记。在其开始采食饲料，直到采食饲料一个月后，日龄为55d 1d时，再次采集这8头特殊标记的仔猪的新鲜粪便。3.1.2选择性培养基分离，生化鉴定和革兰氏染色镜检分离得到的两个时间点断奶仔猪粪样中的大肠杆菌，NLSI标准琼脂稀释法测定其对某些抗生素的敏感性。
4. 研究创新点
本实验中，选择了刚出生后一周的未采食饲料和采食饲料后一个月左右的两个时间点仔猪，尽可能的排除了一些干扰因素，这样来分析影响仔猪大肠杆菌耐药性的变化具体原因，更有说服力。
5. 研究计划与进展
1、研究计划：2013.07-2013.09 粪便样品采集，而后分离、保存，鉴定粪便中的大肠杆菌2014.02-2014.03 大肠杆菌MIC实验2014.04-2014.05 数据分析整理并撰写论文
2、预期进展：分离得到大肠杆菌，并且仔猪在采食饲料后与未采食饲料之前相比，大肠杆菌对抗生素的耐药性有明显的增加。
