1. 研究目的与意义
内容：1. PBF326体外方法学建立
2. PBF326脂质体制备工艺选择
3. PBF326脂质体制备工艺优化
2. 文献综述
脂质体制剂的研发进展
匡 达
摘 要：应用脂质体辅助药物输送已经对许多生物医学领域产生重大影响。脂质体药物普遍具有精确的靶向性和较强的缓释作用，使药物效力明显增强，并解决了很多药物伴随毒性以及特殊部位给药难的问题。在这篇综述中，我们将讨论脂质体辅助药物输送的进展，以及脂质体在生物医学应用中的临床和实验应用现状。
关键词：脂质体；研发进展；靶向；临床
1.介绍
脂质体是目前临床应用最广泛的药物靶向递送系统载体材料。他们能使药物克服细胞和组织吸收障碍，提高药物在靶器官或靶细胞的浓度。脂质体被定义为磷脂囊泡，由一个或多个同心的脂质双分子层组成，它们包围着离散的水空间[1-4]。脂质体系统的独特能力，使亲脂性和亲水性的药物有很好的载药效率，疏水性分子插入双层膜，亲水性分子可以包裹在水中心[1-4]。此外，大型水性中心和磷脂双分子层组成的双层膜允许各种大分子透过并包载在水性空间，如DNA， 蛋白质和显像剂[5-6]。作为药物载体，脂质体具有以下几个优点：生物相容性、自组装能力、高效载药效率，较好的理化性质易于功能性修饰[1-4]。由于脂质体内磷脂双分子层具有与细胞膜类似的结构，所以有较高的生物相容性，较其他DDS(Drug Delivery System)载体材料表现出较高生物相容性。另外，由于肿瘤血管的细胞间隙较正常组织大（约200 nm），所以肿瘤组织对脂质体具有高渗透长滞留效应(Enhanced Permeability and Retention effect, EPR)，使脂质体携带的药物能更好的分布至肿瘤组织并提高滞留时间。
图 1 不同脂质体给药平台
2.脂质体给药平台的类型
一般来说，脂质体输送系统有四个主要类型。传统脂质体也就是最早研究的一类脂质体。该类脂质体由阳离子、阴离子、或中性（磷酸化）的脂肪和胆固醇组成磷脂双分子层，内部包含水性中心（图1）。常规脂质体的研究始于1980年，化疗药物阿霉素经脂质体包装，药代动力学行为和组织分布得以改善，从而提升其治疗指数[8]。常规脂质体制剂能降低化合物在系统的毒性，并且使得药代动力学和生物分布有所提升。但由于该类脂质体容易被富含网状内皮系统(Reticuloendothelial System, RES)的脏器（如肝脏和脾脏）识别并清除，因此限制了其疗效[9]。
为了提高脂质体的稳定性和提高在血液中的循环时间，科学家们使用聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)包裹脂质体。亲水性聚合物PEG，已被证明是获得立体稳定脂质体的最优选择（图1）。经PEG修饰的脂质体表面形成一个空间屏障，从而降低RES识别和清除，使脂质体在体内循环时间延长，增强药物疗效 [10-12]。但聚乙二醇包裹的脂质体有可能因为减少与靶细胞或靶器官的相互作用从而影响疗效[13-15]。
配体靶向脂质体（图1）给药是指在脂质体中加入特定的配体（如抗体，肽/蛋白质和碳水化合物等），该类脂质体能够将药物选择性递送至表达或过表达的受体的细胞或靶器官，从而提高药物递送的特异性的给药方式。适用黏附于脂质体表面的抗体是靶向修饰的有效成分，而其中单克隆抗体是建立免疫脂质体的代表之一[16-17]。但免疫脂质体的体内性能有限，由于不良的药代动力学和免疫原性，已成为其潜在的有效的特异性药物载体的主要障碍。因此，新一代的脂质体利用上述设计平台的组合，进一步改善脂质体靶向和相关的药物递送。例如，目标特异结合的免疫脂质体与PEG的空间位阻稳定整合（从而创造长循环免疫脂质体）显著提高了免疫脂质体的药代动力学[18]。脂质体作为一种药物传递平台，提供了一种动态的、适应性强的技术，以提高各种疾病的治疗的系统疗效。
3.脂质体在生物医学中的应用
脂质体在医学上的应用，为各种病理条件下寻找新的有效治疗方法提供了广阔的前景。自从50年前发现脂质体以来，在体内和体外实验中，以脂质为基础的药物递送研究已经显著增加。脂质体已被广泛应用于化疗药物、基因药物、蛋白药物靶向递送。这些配方的修改不断在努力提高疗效的研究，降低药物清除速率和减少毒性[19]。
主动靶向配体脂质体表面偶联靶向方法已在生物医学领域的实验水平的广泛研究，特别是在非胃肠给药（如静脉注射和腹腔注射等）[21]。此外，脂质体表面电荷也引起了人们的关注。带特异电荷脂质双层的脂质体也在发展生物黏附性中发挥了重要作用[21]。
4.临床批准的脂质体疗法
多种脂质体产品在市场上有更深入的临床开发。多数上市脂质体的递送能力依赖于PEG结合的脂质。事实上，FDA(Food and Drug Administration)批准的第一种纳米药物阿霉素是用聚乙二醇化脂质体递送的[22]。阿霉素通常与其他药物结合使用，如PLD(phospholipase D)，用于治疗各种类型的癌症，包括艾滋病相关的Kaposi肉瘤、白血病、卵巢癌、乳腺癌、骨肿瘤、肺癌和脑癌。当阿霉素加入聚乙二醇化脂质体时，它最大限度地减少了对RES的摄取和清除，从而延长了药物在血液循环中的半衰期。这允许PLD在肿瘤组织中积累，降低在非靶健康组织中积累。此外，使用PLD保证阿霉素可以通过心肌而不被释放，降低对心肌细胞毒性。除了在1995年接受FDA批准使用PLD外，PLD和其他药物（如硼替佐米治疗复发或难治性多发性骨髓瘤）最近得到FDA的批准。
除了PEG结合的脂质，常规和阳离子脂质体为基础的药物也得到了FDA的批准。例如，抗真菌预防的Liposomal amphotericin B，用于治疗白血病和实体肿瘤柔红霉素，用于治疗黄斑变性的维替泊芬，用于治疗脑膜炎的阿糖胞苷、阿糖胞苷和淋巴瘤性脑膜炎和疼痛管理的硫酸吗啡都是目前市场上常规和阳离子脂质体为基础的药物[23]。不管怎样，许多药物仍在进行临床试验，以检验其剂量递增效应和治疗效果，例如，liposomal amphotericin B在一项前瞻性Ⅱ期试验的安全性和耐受性高剂量[23]。这些市场上的药物的优点包括减少毒性增加血管渗透/聚集在靶组织和能力来封装不同的亲脂性药物的同时保护他们免受降解。
自1995年阿霉素（脂质体）在美国上市，标志着以脂质体为基础的药物开始进入人们的生活中，随着时间的推移，陆续有更多以脂质体为基础的药物在国外上市（见表2）。我国第一个以脂质体为基础的药物盐酸多柔比星脂质体注射液也在2013年开始上市，后续几年也有以脂质体为基础的药物在我国上市（见表1）。目前国内外上市的脂质体药物多为治疗癌症的化疗制剂，这些上市脂质体大都创造了巨大的社会和经济效益，因此，企业对脂质体药物的研究成为一个热点。根据我所查阅的资料显示，目前存在许多脂质体药物正处于临床研究阶段（见表3）。自2015年来我们发现脂质体制剂治疗范围已从抗肿瘤药扩展到术后镇痛，心血管疾病等疾病治疗，可见脂质体制剂的研究有着十分良好的前景。
5.结论
应用脂质体辅助药物输送是许多生物医学领域解决药物治疗指数的有效手段。但是迄今为止脂质体技术的进展仍有很多待克服的挑战。持续的转化成功需要在脂质体技术的所有发展阶段的专家之间进行沟通和协作，包括制造和药物设计、细胞相互作用和毒理学以及临床前和临床评价。
表1. 国内上市脂质体药物
药名（商品名） | 生产厂家 | 上市年份 | 制剂类型 | 适应症 | 参考文献 |
盐酸多柔比星脂质体注射液 盐酸多柔比星脂质体注射液 盐酸多柔比星脂质体注射液 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 石药集团欧意药业有限公司 常州金远药业制造有限公司 | 2013.06 2016.08 2017.03 | 注射剂 注射剂 注射剂 | 皮肤粘膜内脏疾病与艾滋病相关的卡波氏肉瘤 | [24] [25] [26] |
注射用两性霉素B脂质体（锋克松） | 上海上药新亚药业有限公司 | 2015.09 | 注射剂 | 抗生素类适用于系统性真菌感染者 | [27] |
注射用紫杉醇脂质体（力扑素） | 南京绿叶制药有限公司 | 2015.07 | 靶向制剂 | 细胞毒性药物 | [28] |
表2. 国外上市脂质体药物
药名 | 药物成分名称 | 上市年份 | 制剂类型 | 适应症 | 参考文献 |
盐酸阿霉素（脂质体） | 盐酸阿霉素 | 2013.02 | 注射剂 | 肿瘤 | [29] |
Marqibo Kit | 硫酸长春新碱 | 2012.08 | 注射剂 | 非霍奇金淋巴癌 | [30] |
Depodur | 硫酸吗啡 | 2004.05 | 注射剂 | 疼痛管理 | [31] |
Visudyne | 维替泊芬 | 2000.04 | 注射剂 | 分子变性 | [29] |
Depocyt | 阿糖胞苷 | 1999.04 | 注射剂 | 肿瘤性脑膜炎和淋巴瘤性脑膜炎 | [31] |
柔红霉素 | 盐酸柔红霉素 | 1998.01 | 注射剂 | 白血病和实体癌 | [29] |
Ambisome | 两性霉素B | 1997.08 | 注射剂 | 抗真菌预防 | [29] |
阿霉素（脂质体） | 盐酸阿霉素 | 1995.11 | 注射剂 | 卡波西斯肉瘤，卵巢癌，乳腺癌 | [30] |
表3. 临床阶段脂质体药物
药名 | 治疗疾病 | 临床阶段 | 开始时间 | 负责国家 | 参考文献 |
安纳霉素脂质体 | 白血病 | 第一阶段/第二阶段 | 2018.01.03 | Moleculin Biotech, Inc（美国） | [32] |
布比卡因脂质体右注射 | 术后镇疼 | 第四阶段 | 2017.12.26 | 格林维尔卫生系统（美国） | [33] |
布比卡因脂质体 | 术后镇痛 | 第二阶段 | 2017.04.10 | 美国纽约 | [34] |
伊立替康脂质体注射剂 | 小细胞肺癌 | 第二阶段/第三阶段 | 2017.03.23 | 美国 | [35] |
纳米脂质体伊立替康的对流增强传递 | 弥漫性脑桥脑胶质瘤 | 第一阶段 | 2017.03.22 | 加利福尼亚大学（美国） | [36] |
前列地尔脂质体用于注射 | 闭塞性动脉硬化 | 第二阶段 | 2016.08.24 | 广州一品红药业有限公司（中国） | [37] |
米托蒽醌盐酸盐脂质体 | 淋巴瘤 | 第一阶段/第二阶段 | 2016.08.05 | 石药集团中奇制药科技有限公司（中国） | [38] |
局部用两性霉素-B 0.4%脂质体凝胶 | 利什曼病(黑热病) | 第二阶段 | 2016.01.15 | 索罗卡医疗中心（以色列） | [39] |
盐酸米托蒽醌脂质体注射液 | 淋巴瘤 | 第二阶段 | 2015.11.05 | 石药集团中奇制药科技有限公司（中国） | [40] |
曲妥珠单抗和非聚乙二醇化脂质体多柔比星 | 乳癌 | 第一阶段 | 2015.09.29 | 法国巴黎 | [41] |
丁胺卡那霉素 | 脓毒症 | 第四阶段 | 2015.02.18 | 齐埃克豪伊森鲁汶大学（比利时） | [42] |
溶血热敏脂质体 | 肝肿瘤 | 第一阶段 | 2014.07.03 | 牛津大学（英国） | [43] |
脂质体阿糖胞苷 | 急性淋巴细胞白血病 | 第二阶段 | 2012.05.08 | National Cancer Institute, Naples （意大利） | [44] |
siRNA-EphA2-DOPC | 癌症 | 第一阶段 | 2012.05.04 | M.D. Anderson Cancer Center（美国） | [45] |
拓扑替康脂质体注射液 | 小细胞肺癌 卵巢癌 实体瘤 | 第一阶段 | 2008.10.03 | Spectrum Pharmaceuticals, Inc （美国） | [46] |
维A酸脂质体 | 淋巴瘤 | 第二阶段 | 2004.04.28 | M.D. Anderson Cancer Center（美国） | [47] |
勒托替康脂质体 | 头部和颈部癌症 | 第二阶段 | 2003.06.17 | 皇帝弗朗茨约瑟夫医院（奥地利） | [48 ] |
参考文献
[1] Koning G A, Storm G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs[J]. Drug Discovery Today, 2003, 8(11): 482-483.
[2] Ding B S, Dziubla T, Shuvaev V V, et al. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium.[J]. Molecular Interventions, 2006, 6(2): 98-112.
[3] Metselaar J M, Storm G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders.[J]. Expert Opinion on Drug Delivery, 2005, 2(3): 465-476.
[4] Hua S, Wu S Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies[J]. Front Pharmacol, 2013, 4: 143.
[5] Ulrich A S. Biophysical aspects of using liposomes as delivery vehicles[J]. Bioscience Reports, 2002, 22(2): 129-150.
[6] Monteiro N, Martins A, Reis R L, et al. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine[J]. Journal of the Royal Society Interface, 2014, 11(101): 20140459.
[7] Szebeni J, Moghimi S M. Liposome triggering of innate immune responses: a perspective on benefits and adverse reactions.[J]. Journal of Liposome Research, 2015, 19(2): 85-90.
[8] Jiang F, Guo-Ying W. LIPOSOMES AS IN VIVO AND IN VITRO CARRIERS OF ADRIAMYCIN: INCREASED TUMORICIDAL EFFECT OF THE DRUG[J]. Chinese Journal of Cancer, 1994.
[9] Gabizon A, Chisin R, Amselem S, et al. Pharmacokinetic and imaging studies in patients receiving a formulation of liposome-associated adriamycin[J]. British Journal of Cancer, 1991, 64(6): 1125-1132.
[10] Torchilin V P, Klibanov A L, Huang L, et al. Targeted accumulation of polyethylene glycol-coated immunoliposomes in infarcted rabbit myocardium[J]. Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 1992, 6(9): 2716-2719.
[11] Northfelt D W, Martin F J, Working P, et al. Doxorubicin Encapsulated in Liposomes Containing Surface‐Bound Polyethylene Glycol: Pharmacokinetics, Tumor Localization, and Safety in Patients with AIDS‐Related Kaposi's Sarcoma[J]. Journal of Clinical Pharmacology, 1996, 36(1): 55-63.
[12] Gabizon A A, Barenholz Y, Bialer M. Prolongation of the Circulation Time of Doxorubicin Encapsulated in Liposomes Containing a Polyethylene Glycol-Derivatized Phospholipid: Pharmacokinetic Studies in Rodents and Dogs[J]. Pharmaceutical Research, 1993, 10(5): 703-708.
[13] Allen T M. Long-circulating (sterically stabilized) liposomes for targeted drug delivery[J]. Trends in Pharmacological Sciences, 1994, 15(7): 215-220.
[14] Moghimi S M, Szebeni J. Stealth liposomes and long circulating nanoparticles: critical issues in pharmacokinetics, opsonization and protein-binding properties.[J]. Progress in Lipid Research, 2003, 42(6): 463-478.
[15] Willis M, Forssen E. Ligand-targeted liposomes.[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 1998, 29(3): 249-271.
[16] Bendas G. Immunoliposomes: a promising approach to targeting cancer therapy.[J]. Biodrugs Clinical Immunotherapeutics Biopharmaceuticals Gene Therapy, 2001, 15(4): 215-224.
[17] Puri A, Loomis K, Smith B, et al. Lipid-Based Nanoparticles as Pharmaceutical Drug Carriers: From Concepts to Clinic[J]. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 2008, 26(6):523-580.
[18] Maruyama K. PEG-immunoliposome[J]. Biosci Rep, 2002, 22(2): 251-266.
[19] Bozzuto G, Molinari A. Liposomes as nanomedical devices.[J]. International Journal of Nanomedicine, 2015, (10): 975-999.
[20] Hua S, Marks E, Schneider J J, et al. Advances in oral nano-delivery systems for colon targeted drug delivery in inflammatory bowel disease: selective targeting to diseased versus healthy tissue[J]. Nanomedicine Nanotechnology Biology Medicine, 2015, 11(5): 1117-1132.
[21] Antoni L, Nuding S, Wehkamp J, et al. Intestinal barrier in inflammatory bowel disease[J]. World Journal of Gastroenterology, 2014, 20(5): 1165-1179.
[22] Ning Y M, He K, Dagher R, et al. Liposomal doxorubicin in combination with bortezomib for relapsed or refractory multiple myeloma.[J]. Oncology, 2007, 21(12): 1503-1508.
[23] Chandrasekar P H. Amphotericin B lipid complex: treatment of invasive fungal infections in patients refractory to or intolerant of amphotericin B deoxycholate[J]. Therapeutics Clinical Risk Management, 2008, 4(6): 1285-1294.
[24] http://app2.sfda.gov.cn/datasearchp/index1.do?tableId=25tableName=TABLE25tableView=国产药品Id=182245
[25] http://app2.sfda.gov.cn/datasearchp/index1.do?tableId=25tableName=TABLE25tableView=国产药品Id=188794
[26] http://app2.sfda.gov.cn/datasearchp/index1.do?tableId=25tableName=TABLE25tableView=国产药品Id=189911
[27] http://app2.sfda.gov.cn/datasearchp/index1.do?tableId=25tableName=TABLE25tableView=国产药品Id=198867
[28] http://app2.sfda.gov.cn/datasearchp/index1.do?tableId=25tableName=TABLE25tableView=国产药品Id=125791
[29] Allen T M, Cullis P R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2013, 65(1): 36-48.
[30] Wang X., Song Y., Su Y., Tian Q., Li B., Quan J., et al. Are PEGylated liposomes better than conventional liposomes? A special case for vincristine.Drug Deliv, 2016,23(4): 19.
[31] Chang H I, Ming-Kung Y. Clinical development of liposome-based drugs: formulation, characterization, and therapeutic efficacy[J]. International Journal of Nanomedicine, 2012, 7: 4960.
[32] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03388749?term=liposomerecrs=abrank=21
[33] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03383198?term=liposomerecrs=abrank=7
[34] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03106545?term=liposomerecrs=abrank=4
[35] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03088813?term=liposomerecrs=abrank=6
[36] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03086616?term=liposomerecrs=abrank=14
[37] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02877173?term=liposomerecrs=abrank=1
[38] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02856685?term=liposomerecrs=abrank=3
[39] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02656797?term=liposomerecrs=abrank=27
[40] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02597387?term=liposomerecrs=abrank=2
[41] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02562378?term=liposomerecrs=abrank=8
[42] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02365272?term=Amikacinrank=3
[43] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02181075?cond=Thermosensitive liposomerank=2
[44] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01593488?term=liposomerecrs=abrank=44
[45] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01591356?cond=siRNA liposomerank=1
[46] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00765973?cond=Topotecan liposomerank=1
[47] https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00005969?cond=Tretinoin liposomerank=1
https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00022594?cond=Lurtotecan liposomerank=13. 设计方案和技术路线
研究方案：
1．PBF326体外方法学建立
利用HPLC建立PBF326体外方法学，并对其方法学进行考察
2. PBF326脂质体制备工艺选择
2.1 脂质体制备方法选择
以脂质体粒径及PDI (Polymer dispersity index)为指标从薄膜分散法、逆向蒸发法、冻融法和乙醇注入法中筛选出最优制备方法。
2.2 PBF326药物装载方式选择
以脂质体粒径、PDI及包封率为指标考察从硫酸铵梯度法、超声载药法和pH梯度法等中筛选出最优制备方法。
3. PBF326脂质体制备工艺优化
以脂质体粒径、PDI、包封率和载药量为指标，利用正交设计对PBF326脂质体载药工艺进行优化，确定最佳载药工艺。
4. PBF326脂质体表征
4.1 利用DLS (Dynamic Light Scattering)技术测定PBF326脂质体粒径、PDI及Zeta电位。
4.2 利用TEM (Transmission electron microscope)技术测定PBF326脂质体形态及分散性。
5. PBF326脂质体稳定性考察
以粒径、PDI、Zeta电位、PBF326稳定性及PBF326泄漏率为指标，考察在不同储存条件下PBF326脂质体的稳定性。
6. PBF326脂质体体外释放评价
利用pH为7.4和5.5的缓冲体系分别模拟血液循环系统和肿瘤组织，透析法考察PBF326脂质体在pH为7.4和5.5的缓冲体系的释放规律。
PBF326脂质体体外释放评价 |
PBF326脂质体稳定性考察 |
PBF326脂质体表征 |
PBF326脂质体制备工艺优化 |
PBF326脂质体制备工艺选择选择 |
PBF326体外方法学建立 |
4. 工作计划
2022年1月
PBF326体外方法学建立
2022年2月
5. 难点与创新点
制备新型且具有靶向性的PBF326长循环脂质体并对PBF326脂质体制备工艺进行优化，降低PBF326心脏毒性和神经毒性，扩大治疗窗口。
