枇杷叶三萜类成分分离开题报告

 2023-01-01 10:46:54

1. 研究目的与意义

内容：

本课题对枇杷叶中的三萜类化学成分进行提取分离，以期为进一步研究和开发枇杷叶提供了依据。

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2. 文献综述

枇杷叶三萜类成分分离综述

摘要：枇杷叶系蔷薇科枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.的干燥叶，是一味常用中药，收载于历版中国药典供中医临床使用。枇杷叶归肺、胃经，具清肺止咳、降逆止呕作用，用于治疗肺热咳嗽、气逆喘气、胃热呕逆、烦热口渴之症状。近年来国内外对枇杷叶的化学成分和药理作用研究较多，分离得到的主要成分为三萜、黄酮类、多酚、倍半萜及其苷类等，其药效主要集中在三萜和倍半萜的抗炎、降血糖和抗病毒活性等方面。

课题内容：

本课题对枇杷叶中的三萜类化学成分进行提取分离，以期为进一步研究和开发枇杷叶提供了依据。

关键词：枇杷叶，三萜，分离

枇杷叶为蔷薇科枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl. 的干燥叶，又名巴叶，在我国分布广泛，主产于广东、江苏、浙江、福建等地，是一味常用中药，收载于历版中国药典供中医临床使用。枇杷叶归肺、胃经，具清肺止咳、降逆止呕作用，用于治疗肺热咳嗽、气逆喘气、胃热呕逆、烦热口渴之症状[1]。近年来国内外对枇杷叶研究较多，其主要成分为三萜[3~11] 、倍半萜及其苷类[13,14]，黄酮类[15,16,17]、多酚类[15,20~23]等，近代研究发现其有抗炎[5,6,24~26]、降血糖[7,13,27~29]、抗肿瘤[21,23,30,31]、抗氧化[15]等活性。

1枇杷叶的植物来源

枇杷属于蔷薇科（Rosaceae）枇杷属（EriobotryaLindl.），约有30多种，目前已知原产我国的有14种和1变种。我国是世界上最主要的枇杷生产国，栽培面积和产量占世界的2/3以上，其中作为人工栽培的只有枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl. 1种，其余的多处野生态，零星分布。

我国原产的枇杷属14个种和1个变种分别是：枇杷E. japonica(Thunb.) Lindl.、大花枇杷E. cavaleriei(Levl.) Rehd.、台湾枇杷E. deflexa(Hemsl.) Nakai.、南亚枇杷E. bengalensis(Roxb.) Hook.、栎叶枇杷E. prinoidesRehd. et Wils.、大渡河枇杷E. prinoidesRehd. et Wils.var. dadijeensis H. Z. Zhang.、麻栗坡枇杷E. malipoensisKuan.、齿叶枇杷E. serrataVidal.、腾越枇杷E. tergyuehensisW. W. Smith.、怒江枇杷E. salwinensisHand. -Mazz.、香花枇杷E. fragransChamp.、倒卵叶枇杷E. obovataW. W. Smith.、椭圆枇杷E. ellipticaLindl.、窄叶枇杷E. benryiNakai.、小叶枇杷E. seguinri (Levl.) Card. et Guillaumin。

中药枇杷叶的基源植物是枇杷E. japonica(Thunb.) Lindl.，其它种和变种均不做中药枇杷叶用。

2枇杷叶的药材特征

本品呈长圆形或倒钟形，长12～30cm，宽4～9cm；先端尖，基部楔形，边缘有疏锯齿，近基部全缘；上表面灰绿色、黄棕色或红棕色，较光滑；下表面密被黄色绒毛，主脉于下表面显著突起，侧脉状；叶柄极短，被棕黄色绒毛；革质而脆，易折断。无臭味微苦。

组织特征：上表皮细胞扁方形，外被厚角质层；下表皮有多数单细胞非腺毛，常弯曲，近主脉多弯成人字形，气孔可见；栅栏组织为3～4列细胞，海绵组织疏松，均含有草酸钙方晶及簇晶；主脉维管束外韧型，近环状；中柱鞘纤维束排列成不连续的环，壁木化，其周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维；薄壁组织中散有黏液细胞并有草酸钙方晶[1]。

3生境分布

枇杷分布于陕西、江苏、浙江、安徽、江西、福建、台湾、广东、广西、湖南、湖北、四川、贵州、云南等地，多栽培于村边、平地或坡地。

4采收加工

药材用枇杷叶全年均可采收，但大多在4~5月间，晒至七八成干时，扎成小把，再晒干。亦有拾取自然落叶者，色较紫。本品分为生用和蜜炙。生枇杷叶：除去绒毛，用水喷润，切丝，干燥。蜜枇杷叶：取枇杷叶丝，用蜜水拌炒，至放凉后不粘手为度。每100kg枇杷叶丝，用炼蜜20kg。

5化学成分研究现状

枇杷叶中的三萜类化合物有20多种，主要为五环三萜，以乌苏烷型和齐墩果烷型为多。其中乌苏烷型三萜16个（1-16）（见图1，表1），齐墩果烷型4个（17-20）（见图2，表2），其他类型三萜4个（21-24）（见图3），它们分别为：ursolic acid （熊果酸，1)，2α-hydroxyursolic acid (2α-羟基熊果酸，科罗索酸，corosolic acid，2)，3β,6α,19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (3)[3]，2α,3α,19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (野鸦椿酸，蔷薇酸，euscaphic acid，4)[4]，3β,19α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (坡模酸，pomolic acid，5)[5]，2α, 3β, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (委陵菜酸，tormentic acid，6)，methyl ursolate(7)[6]，2α, 3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (3-epicorosolic acid，8)，1-β-hydroxyeuscaphic acid (9)[7]，2β, 3β, 19α-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (10)[8]，2β, 3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (11)[9]，23-trans-p-coumaroyltormentic acid (12)，

图1 乌苏烷型三萜化合物母核

Fig. 1 Ursane-type triterpene parent nucleus

表1 枇杷叶中的乌苏烷型三萜化合物

Table 1Ursane-type triterpenes isolated from FoliumEriobotryae

化合物

Compound

R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

R8

R9

1

H

H

H

H

OH

H

H

H

H

2

H

H

OH

H

OH

H

H

H

H

3

H

H

H

H

OH

H

OH

OH

H

4

H

H

OH

OH

H

H

H

OH

H

5

H

H

H

H

OH

H

H

OH

H

6

H

H

OH

H

OH

H

H

OH

H

7

H

H

H

H

OH

H

H

H

CH3

8

H

H

OH

OH

H

H

H

H

H

9

OH

H

OH

OH

H

H

H

OH

H

10

H

OH

H

H

OH

H

H

OH

H

11

H

OH

H

OH

H

H

H

H

H

12

H

H

OH

H

OH

E-coumaroyl-O-

H

OH

H

13

H

H

OH

H

OH

Z-coumaroyl-O-

H

OH

H

14

H

H

OH

H

E-caffeoyl-O-

H

H

OH

H

15

H

H

H

OH

E-coumaroyl-O-

H

H

OH

H

16

H

H

OH

E-feruloyl-O-

H

H

H

H

H

23-cis-p-coumaroyltormentic acid (13)，3-O-trans-caffeoyltormenticacid (14)，3-O-trans-p-coumaroylrotundic acid(15)，3-O-trans-feruloyleuscaphic acid (16)[10]，oleanolic acid（齐墩果酸，17），2α-hydroxyoleanolic acid（山楂酸，maslinic acid，18）[4]，methyl arjunolate (19)，2α,3α,23-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid (20)，usrolic acid lactone (21)，betulinic acid (22)，δ-oleanolic acid (23) [6]，hyptadienic acid (24)[11]。

图2 齐墩果烷型三萜化合物母核

Fig. 2 Oleanane-type triterpene parent nucleus

表2 枇杷叶中齐墩果烷型三萜化合物

Table 2 Oleanane-type triterpenes isolated from FoliumEriobotryae

化合物

Compound

R1

R2

R3

R4

R5

17

H

H

OH

H

H

18

OH

H

OH

H

H

19

OH

H

OH

OH

CH3

20

OH

OH

H

OH

H

化合物21 化合物22

化合物23 化合物24

图3 枇杷叶中其他类型三萜化合物

Fig. 3 Other triterpenes isolated from FoliumEriobotryae

6 药理学研究现状

6.1抗炎、镇咳作用

Kwon[24]报道枇杷叶中的甲基绿原酸是中药的抗氧化剂，可以抑制NFkappaB（核转录因子）在氧化还原反应下被激活，从而减少NFkappaB的依赖基因的表达，有助于抑制炎症的发生和抗突变的作用。动物实验表明[5，25]枇杷叶中的马斯里酸、乌苏酸对角叉菜所致小鼠足肿胀及二甲苯诱导的小鼠耳肿胀有明显的抗炎作用，其中马斯里酸除了对角叉菜所致小鼠足肿胀显示了很强的抑制活性外，同时也能拮抗组织胺引起的过敏性回肠收缩，并抑制释放组织胺的活性。枇杷叶中的枇杷苷、乌苏酸、总三萜酸均能明显延长二氧化硫气体及枸橼酸喷雾所致豚鼠咳嗽的潜伏期，并明显减少咳嗽次数。Banno等[6]报道从枇杷叶中提取的12个三萜酸类化合物对TPA诱导的炎症反应有抑制作用。此外，枇杷叶中含苦杏仁苷，体内缓慢分解出氢氰酸也有止咳作用[26]。

6.2降血糖作用

Noreen[27]等报道，枇杷叶的乙醇提取物对正常家兔有明显但短期的降血糖作用，而对四氧嘧啶糖尿病家兔的降血糖作用不明显。李维林等[28]研究发现70%醇提物和总倍半萜对四氧嘧啶糖尿病小鼠和正常小鼠都有降血糖作用。De Tommasi[7]等人报道，从枇杷叶中分离的三萜酸类成分科罗索酸（corosolic acid）、坡模酸（pomolic acid）和一个倍半萜苷对糖尿病小鼠有降血糖作用，两个三萜酸类成分也能降低正常家兔的血糖水平。Yanagisawa等[13]报道从枇杷叶组织培养中得到的委陵菜酸（tormentic acid）有降血糖作用。陈剑等[29]报道从枇杷叶中分离的一个倍半萜苷化合物可以降低糖尿病小鼠和正常小鼠血糖水平。

6.3 抗肿瘤作用

日本学者Ito等[23]报道，从枇杷叶中分离得到的megastigmane glycosides和三萜酸类化合物对佛波醋（TPA）诱导的Raji细胞EB病毒早期抗原表达及致癌剂亚硝酸盐具有明显抑制作用。Kobayashi等[21]以口腔癌细胞为对象进行了试验，结果发现枇杷叶中的三萜酸类化合物具有较强的抗癌活性，且细胞毒性不显著，是决定体外抗氧化能力和抗肿瘤活性的主要因素。枇杷叶中的乌苏酸对多种致癌、促癌物有抵抗作用，且对多种恶性肿瘤癌细胞有明显细胞毒作用和诱导分化作用及抗血管形成作用[30,31]。

6.4 抗氧化作用

枇杷叶提取物可以明显减少DPPH自由基氧化作用，对小鼠肝脏使用丙二酰硫脲引起的脂质过氧化反应有明显的抗氧化作用。枇杷叶中的黄酮类化合物和绿原酸对采用二氯荧光素法引起的氧自由基有显著的抑制作用[15]。

6.5 抗病毒作用

据Taniguchi等[32]报道，枇杷叶中的2α,19α-dihydroxy-3-oxo-urs-12-en-28-oic acid具抗HIV活性，且从中提取的三萜酸类成分对EBV-EA病毒也显示活性。此外，枇杷叶的醋酸乙酯提取物对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、福式痢疾杆菌等有抑制作用[18]。

6.6 保肝作用

枇杷叶中的齐墩果酸具有保肝、解毒作用，并能对CCl4引起的急慢性肝炎损伤有明显保护作用，其显著降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性，能防止实验性肝硬化的发生[33]。熊筱娟等[34]从实验结果分析认为乌苏酸可能有对抗自由基、抑制脂质过氧化物、增强免疫功能、诱导细胞凋亡的作用。

参考文献

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3. 设计方案和技术路线

研究工艺流程：

枇杷叶 90%乙醇提取 浓缩液乙酸乙酯萃取 乙酸乙酯部分用中压柱C18材料依次用不同浓度醇洗脱 用液相制备（C18柱，甲醇-水系统洗脱）制备单体化合物

4. 工作计划

第一阶段：2022.01文献综述，思路形成，实验方案制定；

第二阶段：2022. 02枇杷叶三萜类成分提取；

第三阶段：2022.03-04枇杷叶三萜类成分的分离与结构鉴定；

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5. 难点与创新点

本课题以三萜类化合物为重点，提取分离枇杷叶的化学成分，以期进一步揭示降血糖作用的化学物质基础。

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